YTH家族蛋白1(YTH domain family protein 1, YTHDF1)在结构上含有一段高度保守的YTH结构域(YT521-B homology domain)，是N6-methyladenosine (m6A)修饰最重要的识别蛋白之一，可通过与终止密码子周围的m6A位点结合，增加mRNA转录复合体的传递，并且可联合翻译启动机制，促进翻译起始及蛋白质合成^[1]。越来越多的研究^[2-3]表明，YTHDF1对肝癌的发生、发展产生重要作用。有研究^[4]发现YTHDF1可参与Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌的进展，Wnt/β-catenin通路是经典的Wnt信号通路，该通路通过对多功能蛋白β-catenin的调节，在肝癌增殖、分化、恶变、转移、凋亡等各个生长阶段都发挥着重要作用，但YTHDF1参与Wnt/β-catenin信号通路的作用机制并不明确。此外，目前关于YTHDF1促进肝癌细胞肿瘤干性的研究鲜有报道，肿瘤干性是指肿瘤细胞自我更新的能力，与肿瘤的生长、进展和复发密切相关^[5-6]。本研究旨在探讨YTHDF1促进肝癌细胞肿瘤干性及激活Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌进展的机制，为肝癌的诊断、治疗和预后提供思路。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   肝癌组织和癌旁肝组织临床样本

6组肝癌及癌旁肝组织临床样本取自上海东方肝胆医院国家肝癌样本库，所有临床样本均经过病理检查诊断定性，在取样前均通过患者或家属的知情同意以及上海东方肝胆医院伦理委员会的审查批准(EHBHKY-K-022)。

1.1.2   细胞系

Hep3B、HepG2、Huh7细胞系购自中国科学院上海细胞库，由本实验室保存。

1.1.3   试验试剂

RIPA裂解液（强）、BCA定量试剂盒、5×上样缓冲液、抗体稀释液、细胞核和细胞浆蛋白提取试剂盒购自碧云天公司。SDS-PAGE电泳胶试剂购自雅酶公司。PVDF膜购自Millpore公司。蛋白质印迹分析所需平衡液、封闭液、转膜液等试剂购自上海博光生物科技有限公司。ACTB抗体购自英国Abcam公司；β-catenin、YTHDF1、HistoneH3抗体购自CST公司；GAPDH抗体购自SantaCruz公司。TRIzol试剂盒购自TaKaRa公司，反转录试剂购自Invitrogen公司。Magna RIP试剂盒购自Millipore。胎牛血清购自Gibco公司、培养基购自Hyclone公司。YTHDF1过表达慢病毒、YTHDF1干扰慢病毒及对照慢病毒均购自上海吉玛制药技术有限公司。嘌呤霉素购自ThermoFisher Scientific公司。CCK8试剂盒购自同仁公司。

1.2   试验方法及步骤

1.2.1   Western印迹法

收集细胞或组织，置于冰上，加入适量RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，4℃摇床放置5 min后, 弃沉淀，收集细胞悬液，4℃ 14 000 r/min离心5 min，取上清BCA法检测蛋白浓度。加入适量上样缓冲液，100℃煮15 min。取等量蛋白上样，行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液室温封闭1 h后分别加入一抗（1∶1 000 YTHDF1和1∶2 000 ACTB抗体）于4℃下孵育过夜。用PBST洗涤后加入相应二抗（羊抗鼠及羊抗兔1∶10 000），室温避光孵育1 h后用PBST洗3次。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统检测蛋白荧光强度，并对目的蛋白的表达水平进行半定量分析。

1.2.2   qRT-PCR

用TRIzol试剂盒提取总RNA后，按照反转录试剂盒操作说明反转录合成cDNA，以cDNA为模板，加入相应引物（表 1），使用SYBR Realtime PCR试剂盒在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems公司）中进行扩增。每个样本重复3次。采用2^－ΔΔCt法对目标基因表达水平进行相对定量分析。

表  1  qRT-PCR所用引物

基因名称	序列		基因名称	序列
hum-YTHDF1-F	ACCTGTCCAGCTATTACCCG		hum-PPARD-F	CAGGGCTGACTGCAAACGA
hum-YTHDF1-R	TGGTGAGGTATGGAATCGGAG		hum-PPARD-R	CTGCCACAATGTCTCGATGTC
hum-18s-F	GGAGAGGGAGCCTGAGAAACG		hum-CD44-F	CTGCCGCTTTGCAGGTGTA
hum-18s-R	TTACAGGGCCTCGAAAGAGTCC		hum-CD44-R	CATTGTGGGCAAGGTGCTATT
hum-MYC-F	GGCTCCTGGCAAAAGGTCA		hum-CD24-F	CTCCTACCCACGCAGATTTATTC
hum-MYC-R	CTGCGTAGTTGTGCTGATGT		hum-CD24-R	AGAGTGAGACCACGAAGAGAC
hum-CCND1-F	GCTGCGAAGTGGAAACCATC		hum-EPCAM-F1	AATCGTCAATGCCAGTGTACTT
hum-CCND1-R	CCTCCTTCTGCACACATTTGAA		hum-EPCAM-R1	TCTCATCGCAGTCAGGATCATAA
hum-CTNNB1-F	AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG		hum-ANPEP-F1	GACCAAAGTAAAGCGTGGAATCG
hum-CTNNB1-R	CGAGTCATTGCATACTGTCCAT		hum-ANPEP-R1	TCTCAGCGTCACCCGGTAG
hum-TCF7-F	CTGGCTTCTACTCCCTGACCT		hum-CD47-F1	AGAAGGTGAAACGATCATCGAGC
hum-TCF7-R	ACCAGAACCTAGCATCAAGGA		hum-CD47-R1	CTCATCCATACCACCGGATCT
hum-MMP7-F	GAGTGAGCTACAGTGGGAACA		hum-THY1-F1	ATCGCTCTCCTGCTAACAGTC
hum-MMP7-R	CTATGACGCGGGAGTTTAACAT		hum-THY1-R1	CTCGTACTGGATGGGTGAACT
hum-AXIN2-F	CAACACCAGGCGGAACGAA		hum-PROM1-F1	AGTCGGAAACTGGCAGATAGC
hum-AXIN2-R	GCCCAATAAGGAGTGTAAGGACT		hum-PROM1-R1	GGTAGTGTTGTACTGGGCCAAT

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1.2.3   RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipita-tion，RIP）实验

按照试剂盒说明书的操作步骤，先在裂解缓冲液裂解RIP实验所需细胞，加入A/G磁珠、免疫沉淀抗体与目的RNA结合蛋白共同孵育，再用磁力架固定磁珠结合复合物，洗去未结合的物质，提取RNA，最后采用qRT-PCR进行分析。

1.2.4   细胞培养及慢病毒感染

用含10% FBS的DMEM培养液培养细胞，置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。在感染病毒前1 d，将约3×10⁵个细胞接种至6孔板，保证感染时细胞融合度为50%~70% 并处于对数生长期。感染时更换新鲜培养液，根据滴度计算所需加入的病毒量，向每孔细胞中加入病毒和病毒增强剂，24 h后换液，感染病毒3 d后加入嘌呤霉素，及时更换培养液，去除死细胞并传代。

1.2.5   亚细胞蛋白质组提取

使用细胞核和细胞浆蛋白提取试剂盒，根据说明书步骤分别提取细胞胞核和胞质蛋白质。

1.2.6   细胞悬浮成球实验

用胰酶将细胞消化后重悬，进行细胞计数，在低黏附6孔板铺5×10³个细胞，设置3个复孔。培养10 d后，显微镜下拍照，随机选取5个高倍镜视野计算成球数量。

1.2.7   克隆形成实验

用胰酶将细胞消化后重悬，进行细胞计数，在6孔板铺5×10³个细胞，设置3个复孔。细胞培养箱中培养10 d后，去除培养基，漂洗、固定、染色后再漂洗，再对每个孔板上的集落进行计数和拍照。

1.2.8   CCK8细胞增殖实验

用胰酶将细胞消化后重悬，进行细胞计数，在96孔板铺5×10³个细胞，每个时间点设置5个复孔。细胞培养箱中培养过夜后，加入CCK8试剂，孵育2 h后检测光密度。

1.3   统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析和绘图。数据以x±s表示，实验组和对照组比较采用配对或独立样本t检验，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

2.   结果

2.1   YTHDF1蛋白在人肝癌组织中表达升高

采用Western印迹法对6组肝癌组织和癌旁肝组织检测YTHDF1蛋白水平的表达情况发现，肝癌组织中YTHDF1的蛋白表达水平显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.001，图 1）。该结果表明，YTHDF1在人肝癌组织中蛋白水平表达升高。

图  1  YTHDF1在人肝癌组织中蛋白水平表达升高

T：肝癌组织；P：癌旁组织。A：肝癌组织和癌旁肝组织的Western印迹结果；B：肝癌组织和癌旁肝组织Western印迹法的定量结果。^***P＜0.001。

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2.2   YTHDF1通过直接结合β-catenin mRNA调控其表达

构建YTHDF1过表达和YTHDF1干扰的Hep3B稳转细胞系，提取蛋白进行Western印迹法实验发现，过表达YTHDF1后，β-catenin的表达增加（图 2A）；干扰YTHDF1后，β-catenin表达下调表达（图 2B）。该结果表明YTHDF1可能以某种方式调控β-catenin的表达。

图  2  YTHDF1调控β-catenin及其下游分子的表达

A：过表达YTHDF1 Hep3B细胞Western印迹结果；B：敲低YTHDF1 Hep3B细胞Western印迹结果；C：过表达YTHDF1 Huh7细胞RIP-PCR定性及定量结果；D：过表达YTHDF1 HepG2细胞胞核质分离Western印迹结果；E：过表达YTHDF1 HepG2细胞胞核质分离Western印迹定量结果；F：过表达YTHDF1 HepG2细胞免疫荧光结果；G：过表达YTHDF1 HepG2细胞Wnt/β-catenin信号通路下游分子qRT-PCR结果；H：过表达YTHDF1 Huh7细胞Wnt/β-catenin信号通路下游分子qRT-PCR结果。ns：P＞0.05, ^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001。

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为了进一步探究YTHDF1以何种方式调控β-catenin的表达，在过表达YTHDF1的Huh7细胞系中进行了RIP-PCR实验（图 2C），结果显示YTHDF1和β-catenin mRNA可直接发生相互作用。另外，细胞核和细胞质的Western印迹（图 2D）及细胞免疫荧光结果（图 2F）显示，过表达YTHDF1的HepG2细胞系核内β-catenin的蛋白水平显著高于对照组（P＜0.05，图 2E）。可见，YTHDF1可能促使β-catenin入核增加。在过表达YTHDF1的Huh7和HepG2细胞系中，对Wnt/β-catenin信号通路的下游分子进行了检测，qRT-PCR结果显示，过表达YTHDF1后，TCF7、AXIN2、CCND1、MYC、PPARD上调表达（图 2H）。以上实验结果表明，YTHDF1可能直接与β-catenin mRNA结合调控β-catenin及其下游分子的表达。

2.3   YTHDF1增强肝癌细胞的增殖能力及肿瘤干性

构建过表达YTHDF1和干扰YTHDF1的Hep3B稳转细胞系，运用qRT-PCR技术在mRNA水平检测肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）分子标志物CD24、ANPEP、EPCAM、CD44、CD47、THY1、PROM1等。结果显示，在过表达YTHDF1的Hep3B细胞系中，CD24（P＜0.01）、ANPEP（P＜0.001）、CD44（P＜0.000 1）、CD47（P＜0.01）、THY1（P＜0.001）、PROM1（P＜0.05）等明显上调（图 3A），在干扰YTHDF1的Hep3B细胞系中，EPCAM（P＜0.000 1）、THY1（P＜0.000 1）、PROM1（P＜0.000 1）等明显下调（图 3B）。并且HepG2细胞成球实验结果表明，过表达YTHDF1组细胞球体体积明显大于对照组（图 3C），细胞球体数量明显多于对照组（图 3D）。另外，平板克隆形成实验（图 3E）结果显示，过表达YTHDF1后，HepG2细胞形成的克隆数显著高于对照组（P＜0.000 1，图 3F），CCK8实验结果(图 3G）表明，过表达YTHDF1的HepG2细胞增殖能力显著高于对照组。以上结果均表明，YTHDF1的上调表达可增强肝癌细胞的肿瘤干性并促进肝癌细胞的增殖。

图  3  YTHDF1增强肝癌细胞的肿瘤干性及增殖能力

A：oe-YTHDF1 Hep3B细胞肿瘤干性标志物的qRT-PCR结果；B：sh-YTHDF1 Hep3B细胞肿瘤干性标志物qRT-PCR结果；C：oe-YTHDF1 HepG2细胞成球实验结果；D：oe-YTHDF1 HepG2细胞成球实验定量结果；E：oe-YTHDF1 HepG2细胞平板克隆形成实验结果；F：oe-YTHDF1 HepG2细胞平板克隆形成实验定量结果；G：oe-YTHDF1 HepG2细胞CCK8实验吸光度结果。ns：P＞0.05, ^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001。

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2.4   YTHDF1高表达预示肝癌患者预后差

利用Kaplan-Meier生存曲线分析YTHDF1蛋白水平高表达与肝癌患者临床预后的关系发现，YTHDF1蛋白水平高表达的患者总体生存期（P=0.001 3）和无病生存期(P=0.001 7)均低于YTHDF1蛋白水平低表达患者。这表明，YTHDF1蛋白水平高表达的患者临床预后较YTHDF1蛋白水平低表达患者更差。

图  4  YTHDF1与肝癌患者临床预后的关系

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3.   讨论

肝癌是全世界癌症相关死亡的最主要原因之一，在我国，肝癌的发病率（9.2%）在所有恶性肿瘤中排名第4，致死率（12.9%）排名第2^[7]。近年来，虽然肝癌的治疗取得了长足的进步，目前针对肝细胞癌的治疗方式也有很多，但肝癌发病的隐匿性强、恶性程度高，大多数肝癌患者的临床结局仍然很差，最终能接受手术治疗的患者占比不足30%^[3]。因此，研究肝癌发生发展的分子生物学机制，为肝癌的诊断、治疗提供新的策略，改善肝癌患者的临床预后具有重要意义。

越来越多的研究^[8-11]表明，m6A甲基化修饰识别蛋白YTHDF1可通过多种机制参与调控肝癌的发生发展。m6A甲基化修饰是指将甲基转移至核酸中腺苷的N-6位置，此过程受甲基转移酶(m6A writers)和去甲基化酶(m6A erasers)及识别蛋白(m6A readers)的调控，而YTHDF1是m6A修饰最重要的识别蛋白之一^[12]。

目前，关于YTHDF1参与Wnt通路促进肝癌进展的机制有很多不同的意见，比如Liu等^[8]发现，在肝癌细胞中，YTHDF1以m6A依赖的方式促进Wnt信号通路跨膜受体FZD5 (Frizzled-5)mRNA的翻译输出，并通过FZD5/Wnt/β-catenin通路发挥促癌作用，通过RIP等实验证明了FZD5 mRNA与YTHDF1的结合。而本研究发现，YTHDF1可能直接与β-catenin mRNA结合促进肝癌的发生发展。另外，Li等^[13]发现，YTHDF1过表达可降低肝癌中CD3+和CD8+ T细胞浸润，推测这可能是由YTHDF1激活TGF-β和Wnt通路诱导产生免疫抑制所导致的。上述YTHDF1调控Wnt通路促进肝癌进展的机制虽然各不相同，但它们之间并不矛盾，正如Luo等^[9]研究发现，多种YTHDF1作用机制在肝癌进展中可发挥协同作用。另外，本研究通过Kaplan-Meier生存曲线分析发现，YTHDF1高表达的患者临床预后较YTHDF1低表达患者差，这与目前很多研究的结论一致，如Zhao等^[14]发现，与肝癌Ⅰ期和Ⅱ期相比，Ⅲ/Ⅳ期的YTHDF1表达显著上调，多变量分析还发现，YTHDF1是总体生存期的独立预后变量。因此，很多研究^[15-19]都认为YTHDF1是肝癌潜在的治疗及预后靶点。本研究探讨YTHDF1促进肝癌细胞肿瘤干性的作用，此前关于YTHDF1促进肝癌细胞肿瘤干性的研究未有明确报道，而本研究发现过表达YTHDF1后，肝癌细胞肿瘤干性指标明显上调，增殖能力显著增强，可见，YTHDF1的上调表达增强了肝癌细胞的肿瘤干性。

本研究也存在很多不足之处，虽然证明了YTHDF1可以直接结合β-catenin mRNA影响Wnt/β-catenin通路，但没有应用信号通路的研究方法对YTHDF1参与Wnt/β-catenin通路的潜在机制进行深入探究，此外，YTHDF1影响β-catenin表达的作用方式及促进肝癌细胞肿瘤干性的内在机理也还需要进一步验证。

综上所述，YTHDF1在肝癌发生发展中的复杂机制仍需要更加全面深入的研究。