2023, Vol. 30
2. 上海市重大传染病与生物安全研究院, 上海 200032;
3. 上海市肺部炎症与损伤重点实验室, 上海 200032
2. Shanghai Institute of Major Infectious Diseases and Biosafety, Shanghai 200032, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Lung Inflammation and Injury, Shanghai 200032, China
铜绿假单胞菌是从院内感染和呼吸危重症患者体内最常分离得到的革兰阴性杆菌之一。铜绿假单胞菌通过鞭毛、菌毛、外膜系统等黏附在气道上皮表面，最常定植于囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病患者肺内造成反复感染，影响患者生活质量。在原有治疗的基础上，针对铜绿假单胞菌主要耐药机制寻找新的治疗靶点及药物是亟待解决的关键问题。
人呼吸道宿主防御蛋白短腭、肺和鼻上皮克隆1（short palate, lung and nasal epithelial clone 1, SPLUNC1）是一种具有抗生物膜活性的抗菌肽，是固有免疫系统的重要组成部分，对维持肺脏生理稳态至关重要。SPLUNC1在近端气道上皮高表达，气管分叉后表达逐渐减少，远端气道和肺组织中几乎不表达[1]。SPLUNC1可通过抑制上皮细胞钠离子通道的活性调节肺脏钠水转运，维持气道表面液体层厚度[2]；其作为一种肺泡表面活性物质可以降低肺泡表面张力，防止肺泡萎陷[3]；此外，SPLUNC1还可抑制脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌增殖，发挥抗菌、抗炎作用，也具有抗病毒活性[4-6]。
人源性SPLUNC1的晶体结构在2013年被首次报道[8]。SPLUNC1是由1个弯曲的β折叠和两侧的α螺旋组成“超级卷曲”结构，β折叠和α螺旋共同包绕形成1个富含亮氨酸的疏水结构[2, 7-8]。SPLUNC1的功能与其特定的分子结构密切相关[9]。其蛋白二级结构中有1个由30个氨基酸残基组成的α螺旋结构域，被称为α4。α4及该区域内的亮氨酸残基能使SPLUNC1蛋白定位于气液交界面[2]。既往研究[2]表明，α4是SPLUNC1抑制细菌生长的必须结构域，帮助SPLUNC1与铜绿假单胞菌结合后在其外膜上打孔，从而抑制其生长。人工合成的α4同样具有抗生物膜特性。本研究将α4改造为α4-短肽，观察该短肽对铜绿假单胞菌生长以及生物膜形成的影响，并选取临床上的耐药菌进行验证，为α4-短肽应用于临床提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验菌株的获取和处理铜绿假单胞菌标准株PAO1由美国加州大学旧金山分校赠予，扩增后用细菌冻存液（碧云天，D0391）重悬，分装于无菌的200 μL EP管中，﹣80℃冻存。每次使用前用无菌LB培养基重悬，3 000×g离心10 min，弃上清，重新加入6 mL LB培养基重悬，固定于恒温（37℃）摇床上220 r/min培养18 h；3 000×g离心10 min，去除上清培养基，6 mL无菌PBS重悬后再次离心，弃上清，无菌PBS重悬，使用酶标仪测量光密度（D600）值，将菌液D600值调整为0.5。前期实验表明，当D600＝0.5时，细菌浓度为2×108 CFU/mL。
1.2 细菌生长曲线检测α4-短肽受赠于美国匹兹堡大学Peter Di教授，使用时以相应终浓度加入含PAO1菌株的LB培养基中，固定于恒温（37℃）摇床上220 r/min震荡，每隔1 h取出，置于酶标仪中检测D600并记录。以D600为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制细菌的生长曲线。最低细菌浓度（MIC）为细菌生长完全抑制的最低浓度。
1.3 生物膜形成实验检测96孔聚苯乙烯微孔培养板中，每孔加入100 μL培养液，接种10 μL过夜培养菌液，37℃静置孵育36 h后将培养液吸出，每孔加入200 μL无菌PBS清洗孔板3次；每孔加入100 μL甲醇固定15 min，弃去后自然风干。加入100 μL 1%结晶紫溶液，室温下染色5 min；吸出结晶紫溶液，用流水把多余的染料冲洗干净。把孔板倒置在滤纸上除去残余的水分，37℃烘箱中烘干或室温晾干；完全干燥后，每孔加入100 μL 33%冰乙酸溶液，37℃培养箱中作用30 min以溶解结晶紫。用酶标仪测定培养孔中溶液的D590值，每次实验每种菌株做3个复孔；以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界值(Dc)。基于D值，菌株可分为3类：强生物被膜形成株（D＞2×Dc）；弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）；无生物被膜形成株（D≤Dc）。
1.4 细胞感染实验RAW264.7细胞购买于中科院，在37℃、5%CO2的条件下用含有10%血清（Gibco公司）的DMEM/高糖培养基（Sigma公司）培养。将细胞消化后接种于6孔板中，当密度达到70%~80%时，用相应终浓度的α4-短肽预处理细胞1 h，将PAO1按照上述方法定量后以感染复数（MOI）=10加入，2 h后收集细胞。用TRIzol提取总RNA，对RNA进行定量后，根据逆转录试剂盒（翌圣，11141ES60）说明书将RNA反转录成cDNA。cDNA产物稀释5倍后用SYBR Green PCR试剂盒（翌圣，11202ES08）进行荧光定量，基因表达的相对倍数变化用2﹣ΔΔCt法进行计算。引物序列（5'—3'）：IL-6前引物为CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC，后引物为CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT；TNF-α前引物为GACGTGGAACTGGCAGAAGAG，后引物为TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG；GAPDH前引物为AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，后引物为TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。
1.5 临床血标本菌株分离筛选临床病例，严格遵循无菌操作原则，采集患者的静脉血5~10 mL，注入血培养瓶，置于自动血培养仪中，仪器报告阳性时转接种至相应血平板分离致病菌。
1.6 统计学处理采用SPSS 21.0处理数据，符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间采用方差分析，不符合的以M(P25, P75)表示，采用秩和检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 α4-短肽对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响结果（图 1）显示：与空白对照相比，PAO1组培养基浑浊度明显增加，细菌生长迅速，菌数以指数级增长后缓慢进入平台期。α4-短肽可以减缓PAO1的增殖速度，4 μmol/L时可以明显减缓细菌生长速度，8 μmol/L时已基本抑制细菌生长。
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| 图 1 α4-短肽对PAO1生长曲线的影响 空白对照：不添加菌株、无α4-短肽、纯培养基孵育；0 μmol/L：无α4-短肽；1~16 μmol/L：向PAO1菌株中添加相应终浓度的α4-短肽后孵育。 |
体外生物膜形成实验（图 2）显示：α4-短肽可以明显抑制铜绿假单胞菌标准株PAO1生物膜的形成，且抑制效果随其浓度增加而增加，8 μmol/L时抑制率达最佳（大于50%，P＜0.001）。
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| 图 2 α4-短肽对PAO1生物膜形成的影响 *P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001与α4-短肽0 μmol/L组相比; n＝3, x±s。 |
α4-短肽预处理RAW264.7细胞1 h，换用无血清无双抗的不完全培养基，30 min后加入PAO1，2 h后收集细胞，荧光定量qPCR结果（图 3）显示：PAO1刺激2 h后，RAW264.7细胞中促炎因子IL-6和TNF-α的mRNA表达明显上调；α4-短肽预处理可以逆转由PAO1引起的IL-6和TNF-α的mRNA表达上调，且呈一定剂量依赖性，α4-短肽8 μmol/L时效果最佳（P＜0.001）。
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| 图 3 α4-短肽对PAO1刺激下RAW264.7细胞IL-6和TNF-α mRNA表达的影响 ***P＜0.001与空白对照组相比；△P＜0.05、△△P＜0.01、△△△P＜0.001与含PAO1、不含α4-短肽组相比; n＝3, x±s。 |
筛选病例，收集铜绿假单胞菌感染患者的血标本，分离得到4株铜绿假单胞菌多重耐药菌株和2株肺炎克雷伯菌耐药菌。细菌生长曲线（图 4）显示：α4-短肽对耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌和多重耐药的铜绿假单胞菌均有抑制作用。铜绿假单胞菌多耐药菌最低抑菌浓度有2株为8 μmol/L、1株为16 μmol/L，1株超过了16 μmol/L；耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度1株为4 μmol/L、1株为8 μmol/L。
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| 图 4 α4-短肽对多重耐药铜绿假单胞菌或耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌生长曲线的影响 A：铜绿假单胞菌耐药菌株1；B：铜绿假单胞菌耐药菌株2；C：铜绿假单胞菌耐药菌株3；D：铜绿假单胞菌耐药菌株4；E：肺炎克雷伯菌耐药菌株1；F：肺炎克雷伯菌耐药菌株2。空白对照：不添加菌株、无α4-短肽、纯培养基孵育；0 μmol/L：无α4-短肽；1~16 μmol/L：向菌株中添加相应终浓度的α4-短肽后孵育。 |
目前抗铜绿假单胞菌的治疗主要为抗生素联合支持治疗，但多种抗生素联合使用易引起肾功能不全等严重不良反应[10]。此外，新型抗生素研发周期较长，且不能解决耐药问题。近年来以非抗生素为主的治疗策略也取得了一些突破，如负压封闭引流治疗铜绿假单胞菌相关创面感染已成为处理创面、控制感染、促进愈合的重要手段之一[11]。寻找其他非抗生素治疗肺部感染的新策略或许可弥补目前临床用药的不足。
SPLUNC1对肺部感染模型的肺组织保护作用与其抑制革兰阴性菌生长、抑制细菌生物膜形成、促进其他抗菌蛋白表达、促进黏液清除、降低肺泡表面张力等机制密切相关，且作为一种化学趋化因子可以促进巨噬细胞和中性粒细胞迁移，维持中性粒细胞弹性蛋白酶的功能[1, 12]。SPLUNC1的功能与其结构密切相关，α4是SPLUNC1抑制细菌生长的一个重要的结构域。α4的结构相对保守，与天然抗菌肽类似，具有阳离子性和两亲性；仅将该螺旋结构的4个亮氨酸残基突变为丙氨酸，SPLUNC1促进肺水转运和抑制细菌增殖的能力即可被明显抑制[2]。因此α4有可能成为临床上潜在的治疗靶点。Peter Di教授团队[13]将α4由30个氨基酸残基减少到24个氨基酸残基，同时将赖氨酸的数量增加至6个，不改变疏水性残基的数量，由此增加了阳离子和疏水性基团的密度，形成了α4-短肽，并证实α4-短肽具有广谱杀菌和抗生物膜的特性，且不会引起溶血、细胞毒性等不良反应。
本研究进一步研究验证了α4-短肽对铜绿假单胞菌的作用，发现α4-短肽可明显抑制铜绿假单胞菌标准株PAO1体外增殖，4 μmol/L时即可减缓细菌增殖但不能完全抑制，8 μmol/L可完全抑制细菌体外增殖；α4-短肽可明显抑制PAO1生物膜的形成，抑制率呈一定剂量依赖性，8 μmol/L时抑制率最佳，可达到约50%；同时，通过小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞发现，其可逆转促炎因子PAO1引起的IL-6和TNF-α水平的升高，呈一定剂量依赖性，8 μmol/L时效果最佳。本研究从多重耐药菌感染患者的血标本中分离得到4株铜绿假单胞菌多重耐药菌株和2株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，体外细菌生长曲线显示，α4-短肽对这2类耐药菌均有较好的抑制效果，其中，铜绿假单胞菌多重耐药菌株最低抑菌浓度分别为8、16、＞16 μmol/L，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度分别为4、8 μmol/L，在药物剂量安全范围内可进一步提高药物浓度。α4-短肽的杀菌作用与其对细菌的破膜作用密切相关，且抗菌肽与细菌表面液体层结合后使其黏附于固体表面的能力减弱，从而抑制生物膜的早期形成[13]。
综上所述，α4-短肽可以明显抑制PAO1的体外增殖和生物膜形成，降低因PAO1感染引起的炎症反应，且对临床分离到的耐药菌株有良好的抑制效果。α4-短肽抗临床耐药菌的效果还需更大样本量的耐药菌株的验证。基于现有抗菌肽结构改造的新药研发为临床上治疗耐药菌感染提供了新的思路。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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