2022, Vol. 29
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）由超过200个核苷酸构成，且无明显蛋白质编码功能[1]。LncRNA在哺乳动物基因组中广泛存在，既往lncRNA被认为是“转录噪音”，而近期越来越多的研究[2-3]提示该类RNA是重要的功能分子。目前研究[4-7]提示lncRNA主要作用机制包括以下几个方面，（1）信号功能：作为信号分子调控靶基因的表达；（2）诱饵功能：lncRNA能诱导转录因子或蛋白质远离染色质进而抑制靶基因转录；（3）操纵功能：lncRNA能招募染色质修饰酶，使其接近或远离靶基因从而发挥调控作用；（4）脚手架功能：lncRNA能与蛋白质聚集进而形成核蛋白复合体，从而参与组蛋白的修饰。研究[4-7]发现lncRNA在肿瘤的发生发展中具有重要作用，而在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）研究领域lncRNA的作用也越来越被重视。本研究旨在探讨LINC00922在PDAC中表达差异及其对PDAC细胞系增殖、迁移及侵袭的调控作用。
1 材料与方法 1.1 一般资料选取2015年至2016年在复旦大学附属中山医院普通外科接受手术治疗的4例PDAC患者肿瘤标本及癌旁组织作为高通量测序材料，由南京世和基因公司采用illumina HiSeq X Ten高通量测序仪进行RNA高通量测序。高通量测序后，针对每个样本，利用HISAT软件将预处理序列与测序物种的参考基因组序列进行序列比对，获得lncRNA及mRNA表达谱热点图。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（Y2019-060），并获得患者及家属知情同意。
1.2 主要试剂及仪器人PDAC细胞系CFPAC-1、Capan-1、BxPC-3购自中国科学院细胞库；CCK-8试剂盒购自英国Abcam公司，RT-qPCR试剂盒、RNAiso Plus购自日本TaKaRa公司，Transwell小室购自美国康宁公司。
1.3 RNA提取及RT-qPCR另选取2015年至2017年在复旦大学附属中山医院普通外科接受手术治疗的10例PDAC患者肿瘤标本及癌旁组织作为验证组。按照RNAiso Plus试剂盒操作步骤提取RNA，以及按照RT-qPCR试剂盒操作步骤进行反转录和PCR检测，检测验证组10例PDAC组织及配对癌旁组织中LINC00922表达量。LINC00922引物序列由上海生工合成，正向引物：5'-CTTGCTCGCTGATGCTGCCACG-3'；反向引物：5'-CAGGAGGCTCCAAAGACAGG-3'。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
1.4 CCK-8实验采用LINC00922敲低慢病毒和阴性对照慢病毒感染PDAC细胞系BxPC-3，获得低表达LINC00922的PDAC细胞株及阴性对照细胞株。将处于指数生长期的PDAC细胞BxPC-3接种于96孔板中，每孔103个细胞，每组设3个复孔，分别孵育24 h、48 h、72 h后，每孔按照1∶10比例加入CCK-8检测试剂。并在37℃温箱孵育1 h。用酶标仪检测450 nm处光密度值，绘制细胞增殖曲线。
1.5 划痕实验采用LINC00922敲低慢病毒和阴性对照慢病毒感染PDAC细胞系BxPC-3，获得低表达LINC00922的PDAC细胞株及阴性对照细胞株。将PDAC细胞系BxPC-3消化计数后，将1×105个PDAC细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁生长后，用200 μL枪头垂直于培养板孔中轻划1条直线，加入2 mL无血清培养基继续培养。分别于0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h观察细胞划痕的愈合情况。
1.6 Transwell实验将BxPC-3细胞数目稀释为5×105/mL，将200 μL细胞悬液加入24孔板上层小室，将500 μL含有10%FBS的培养基加入到下层小室，孵育细胞48 h。用4%甲醛固定15 min，并用0.5%结晶紫染色15 min，观察细胞侵袭情况。
1.7 统计学处理采用SPSS 24.0分析数据，采用配对t检验和独立样本t检验，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 PDAC组织lncRNA及mRNA表达谱分析通过高通量测序，获得PDAC lncRNA及mRNA表达谱（图 1），发现PDAC组织中差异表达lncRNA有470个，mRNA有4 373个，并选取表达上调显著的LINC00922作为研究对象。
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| 图 1 4对胰腺癌组织与对应癌旁组织高通量测序热点图 A：差异表达lnRNA聚类分析；B：差异表达mRNA聚类分析。红色：表达上调基因；绿色：表达下调基因。 |
结果（图 2A）提示，PDAC组织中LINC00922表达量显著高于癌旁组织（P < 0.05）。同时使用RT-qPCR检测PDAC细胞系CFPAC-1、Capan-1、BxPC-3及胰腺上皮细胞H6C7中LINC00922表达量，结果（图 2B）提示，BxPC-3中LINC00922表达量显著升高，H6C7正常胰腺导管上皮细胞，并将BxPC-3细胞系做为后续研究对象。
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| 图 2 LINC00922在10对胰腺癌组织和癌旁组织（A）及胰腺癌细胞株中表达情况（B） |
CCK-8实验结果（图 3）提示，敲低LINC00922表达PDAC细胞BxPC-3增殖能力显著低于阴性对照组（P < 0.05）。
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| 图 3 CCK-8增殖实验 |
划痕实验结果（图 4A）提示，敲低LINC00922表达的PDAC细胞BxPC-3较阴性对照细胞更慢地靠近划痕区域（72 h，P < 0.05）。Transwell实验结果（图 4B）显示，敲低LINC00922表达组PDAC细胞穿膜细胞数量低于阴性对照组（P < 0.05）。上述结果提示，敲低LINC00922表达对PDAC细胞系BxPC-3的迁移和侵袭具有抑制作用。
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| 图 4 侵袭迁移实验 A：划痕实验；B：Transwell实验。 |
目前研究[2-3]提示lncRNA具有多种生物学功能，且越来越多的研究[4-7]发现，lncRNA在肿瘤的发生发展中具有重要作用，而其在PDAC中的作用也越来越被重视。Deng等[8]研究发现，缺氧环境可以诱导PDAC细胞中lncRNA BX111表达，且BX111表达上调可以激活转录因子ZEB1，进而促进PDAC的增殖及侵袭转移。Zhang等[9]研究发现，在PDAC组织及PDAC细胞系中高表达lncRNA PMSB8-AS1，且高表达PMSB8-AS1患者预后差；功能研究发现，PMSB8-AS1能够促进PDAC细胞增殖、迁移及侵袭；机制研究发现，PMSB8-AS1能够与miR-382-3p结合，从而下调其表达，进而促进STAT1表达。Zhou等[10]研究发现，在吉西他滨耐药PDAC细胞系中高表达lncRNA PVT1，且功能实验提示PVT1能够促进PDAC细胞系对吉西他滨耐药；机制研究发现，PVT1通过激活Wnt/β-catenin信号通路及细胞自噬通路进而促进PDAC细胞对吉西他滨耐药。
LINC00922作为新近发现的促癌基因，可促进多种肿瘤的发生发展[11-13]。Liang等[11]研究发现，在肺癌组织及肺癌细胞系中高表达LINC00922，可促进肺癌细胞PC9及A549增殖、迁移及侵袭；机制研究发现，LINC00922通过调控miRNA-204/CXCR4轴，进而调控CXCR4表达从而促进肺癌细胞的侵袭转移。此外，Wang等[12]研究发现，在卵巢癌组织及细胞系中也高表达LINC00922，且与卵巢癌患者预后密切相关。下调LINC00922表达能够抑制卵巢癌细胞的侵袭转移以及EMT。机制研究发现，LINC00922竞争性地结合miR-361-3p，进而抑制miR-361-3p对其靶基因CLDN1的调控。目前LINC00922在PDAC中表达情况以及其在PDAC中作用及机制仍不明。
综上所述，本研究首次探讨LINC00922在PDAC组织中表达情况，提示PDAC组织中显著高表达LINC00922。且体外实验提示，敲低LINC00922表达可以降低PDAC细胞系BxPC-3的增殖、迁移及侵袭能力。因此，LINC00922作为PDAC的促癌基因具有深入研究的价值，进一步研究将聚焦其促进PDAC侵袭转移的分子机制。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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