2019, Vol. 26
2. 解放军总医院骨科, 北京 100853
2. Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是创面感染的常见细菌之一，常见于大面积烧伤、严重创伤、糖尿病足、压疮或免疫功能低下的患者。最新研究数据显示PA感染在感染创面中占比高，而且有逐年上升趋势[1-2]。PA感染在创伤后8 h内即可在创面形成生物膜，其引起的创面炎症反应强于金黄色葡萄球菌[3]，感染创面面积更大，病程更长，致残率、致死率更高，是阻碍慢性感染创面愈合的首要致病因素[4]。负压创面疗法(negative pressure wound therapy，NPWT)又被称为负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)[5]或负压辅助闭合(vacuum-assisted closure，VAC)[6]，是近20年来创面治疗领域的最大创新。临床应用以来，在世界范围内对各种创面处理产生了重大影响，也被广泛用于治疗PA感染创面，目前已经成为处理创面、控制感染、促进愈合的重要手段之一。且对于NPWT控制PA感染的作用机制，目前也有了较深入的研究。本文叙述了近些年负压封闭引流治疗PA感染创面的最新研究成果，对其研究机制进行汇总和分析，并探讨了进一步研究的方向。
1 细菌数量的变化开放创面常伴有细菌污染，创面感染的进展与细菌数量相关，因此细菌数量一直是感染创面治疗研究中的基本检测指标。国内外诸多学者将NPWT应用于各种感染性软组织损伤的治疗，取得了良好的效果[7-9]，但对于PA和其它不同菌属清除效果不尽相同。Mouës等[10]在临床随机对照研究发现：与传统换药相比，VAC能够显著促进感染创面的缩小与修复，但细菌总量却增加了，其中金葡菌显著增加，而非发酵革兰氏阴性菌减少。Sheppard等[11]对34例肢体开放性战创伤行VAC治疗的患者进行研究发现：伤后每周从活组织培养细菌(>105 CFU/g)的发生率为28%(第1周)，31%(第2周)和37%(第3周)，其中假单胞菌仅在第1周出现2例，占所有总数的3.7%，VAC确实能减少假单胞菌数量。
为了研究NPWT对PA的清除作用，学者们还做了深入的实验研究。Lalliss等[12]进行了感染性软组织损伤合并开放性骨折的动物实验，结果显示NPWT治疗能够显著减少PA，而对金葡菌并无清除作用。VAN Hecke等[13]比较了普通非黏性敷料与聚乙烯醇和聚氨酯敷料结合NPWT对马尸体腹部肌皮瓣创面体外的抗菌作用，发现在进行12 h处理之后，NPWT-聚乙烯醇敷料组的PA的细菌数量在每个时间点显著低于其他组，NPWT组的PA细菌数量均低于无负压治疗的非粘性敷料组。
尽管临床研究在研究对象、创面类型、感染细菌的种类、处理步骤和研究方法等方面都缺少一致性，但结果表明NPWT与细菌生长动力学之间存在复杂的关系，表现出菌属选择性抑制的特点，能够抑制包括PA在内的非发酵革兰阴性菌的增殖[14]。因此，最大限度控制干扰因素的实验研究结果更为可信，来自这些研究的数据进一步证实了NPWT能够选择性抑制假单胞菌属的结论。在早期研究中，作者认为NPWT增加创面血流量，改善了氧合作用，增强了受损组织对感染的抵抗力，进而提高了细菌清除率；他们推测局部组织氧合作用的增加会减少厌氧菌的生长，增强中性粒细胞的氧化爆发来而破坏细菌[6]。在使用消除了免疫系统影响的离体模型研究中，同样观察到PA数量的减少，说明NPWT的物理作用能够改变细菌生长的微环境，从而抑制PA的增殖[13, 15]。
2 对生物膜的作用PA极易形成保护菌落聚集体的生物膜。成熟的生物膜不但帮助PA逃避免疫系统，还可阻止外源性抗菌物质进入，为细菌提供有利的繁殖环境，是慢性感染形成及难以治疗的关键因素[16]。在PA导致持续慢性感染时，大量中性粒细胞的趋化集中，并非完全有利于PA的清除。相反，源于中性粒细胞的肌动蛋白和DNA所形成聚合物，利于PA早期生物膜的形成[17]。PA生物膜的存在会诱发持续低效的炎性反应，阻碍组织修复并加重损伤，无法成功地进入增生性阶段及再上皮化或重塑阶段，导致创面难以愈合[3]。
随着研究的深入，学者们进一步就NPWT对创面内PA生物膜的作用进行了探索。2012年，Ngo等[15]应用体外模型观察到NPWT能够压缩PA生物膜厚度，并缩短生物膜的扩散距离。Phillips等[18]采用猪皮体外感染生物膜模型，发现间歇负压引流结合不同消毒液冲洗，可以有效裂解PA生物膜的胞外聚合物基质，杀伤生物膜内的细菌。Tahir等[19]同样采用体外模型研究消毒液或抗菌药物溶液冲洗及联合NPWT冲洗的效果，认为单独应用NPWT能通过降低生物膜厚度和质量来改变生物膜结构，联合聚维酮碘和聚六亚甲基双胍抗菌溶液冲洗可以进一步发挥协同效应，减少生物膜活细菌的数量。还有学者研究了单独应用聚氨酯敷料或载银微粒聚氨酯敷料，及与NPWT联合应用对体外生物膜细菌模型的作用，发现在没有负压作用的情况下，两种敷料均不能显著减少PA的数量，而NPWT结合载银微粒聚氨酯敷料对生物膜细菌具有显著的协同杀伤效应，扫描电镜证实仅有少量稀疏PA生物膜残留，在3 d、5 d后均能完全灭活细菌[20]。
由于生物膜结构特性和研究方法的局限，目前对于NPWT对PA生物膜作用的探索以体外实验研究为主。NPWT通过海绵敷料可以将体外负压转化为对创面正压力，这一物理作用能够压缩生物膜结构，反映在生物膜厚度和扩散距离的降低[15]。而在间歇负压循环模式下，海绵敷料网状开孔结构产生宏观形变和微形变的剪切力可以充分改变生物膜胞外聚合物的基质结构，能增强杀菌消毒液和抗菌药物对生物膜的渗透，进而分离或灭活生物膜内细菌，游离出来的细菌在随后的负压引流中被清除[18]。而NPWT与载银敷料的协同杀菌效果也说明，NPWT通过物理作用破坏生物膜结构，是银粒子能够穿透生物膜杀伤细菌的基础[20]。体外研究的数据可能基于缺乏临床相关性的实验室方法，在临床使用时能否转化为相同的疗效或结果，需要通过深入进行动物模型或临床研究进行验证。
3 细菌毒力的变化PA分泌的各种毒素也是破坏创面组织和阻碍愈合的因素之一，其中外毒素A、鼠李糖脂和弹性蛋白酶是主要毒力因子。外毒素A是一种相对分子质量66 000的酶，可以阻止细胞蛋白合成，导致组织坏死[21]。鼠李糖脂具有热稳定的细胞外溶血特性，可快速导致多形核细胞坏死，阻碍机体免疫系统对细菌的清除作用[22]。弹性蛋白酶能导致组织损伤和炎症，降解基质蛋白、血浆蛋白及补体C3，还能抑制成纤维细胞生长[23]，弹性蛋白酶既可以破坏软组织、阻碍免疫清除作用，又可以抑制创面组织修复过程。此外，PA中还存在着群体感应(quorum sensing，QS)系统，其中结合3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-O-C12-HSL)的Las系统和结合丁基高丝氨酸内酯(C4-HSL)的Rhl系统都在皮肤和创面感染中发挥作用，可调控各种毒力因子的分泌[24]。
Wang等[25]在2016年首次报道了NPWT产生的体外负压环境对PA毒力因子的影响，发现相对于正常大气压下，负压作用24 h后PA分泌的外毒素A，鼠李糖脂和弹性蛋白酶显著减少；其毒力因子、Las和Rhl群体感应系统的基因相对表达也明显下调。之后他们又以兔耳软组织损伤模型进行了相关的动物实验，在NPWT治疗6 d后，外毒素A、鼠李糖脂、弹性蛋白酶和生物膜毒力因子eDNA(extracellular DNA)均显著减少，病理结果显示NPWT治疗后上皮和肉芽组织间隙显著改善，同时新生上皮和肉芽组织明显增加[26]。
普遍认为PA是一种条件致病菌，自身的毒力及侵袭性相对较弱，因此NPWT治疗对PA毒力影响的相关研究极少。NPWT的抽吸和引流作用可以排出来自创面、细菌和渗出物的毒素，这是创面内细菌毒素减少的机制之一[27]。其次，毒力因子基因表达的下调也可导致毒力因子合成的减少。目前已有研究表明，抑制PA的QS系统可减少毒力因子的表达，控制感染[28]。抑制QS系统可能是其影响细菌增殖发育，降低毒力侵袭的作用途径之一，但其内在机制有待深入研究。
4 炎症反应的调控临床研究证实，负压治疗环境能够影响炎症反应。Labler等[29]发现，在使用VAC治疗软组织开放性创面的引流液中IL-8显著升高，活组织病理中可见嗜中性粒细胞的聚集。Karam等[30]的研究亦表明，应用NPWT可明显减少创面引流液中TNF-α的含量。Eisenhardt等[31]发现，NPWT可显著减少CD68+巨噬细胞的组织浸润，并减少IL-1β和TNFα的表达。结果提示NPWT能够通过免疫调节作用，抑制或降低炎性反应的强度，降低持续炎症带来的自身损害，有利于感染控制与创面修复。
PA感染创面常表现为持续低效的炎性反应，阻碍组织修复并加重损伤，甚至引起脓毒血症[3]。Liu等[32]以小鼠烧伤感染PA败血症为模型，检测了治疗期间IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的血清浓度，在治疗3 d后，还对受伤的皮肤，肺，肝和肾组织进行了组织病理学检查，结果显示：与干湿纱布换药相比，NPWT降低了细菌数量和血清内炎症因子浓度、避免了重要脏器的损伤，减少了脓毒血症，降低了实验动物的死亡率。由此认为NPWT通过限制细菌增殖和减轻败血症进展来有效地降低炎症程度。
Wang等[25]进行的动物实验检测了创面局部IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达，以及创面不同深度层面的中性粒细胞计数，发现NPWT可以抑制创面局部炎性因子过度表达，进而降低创面炎症反应程度。这一现象的可能机制有：负压的物理环境对创面细胞的生理活动有所改变，从而对炎性因子的表达产生影响；NPWT可以将创面的分泌物以及非定植细菌及时引流至体外；炎性因子表达的减少，减弱了对中性粒细胞的趋化作用，从而缓解感染状态下的过度炎症反应。但目前，NPWT负压环境对PA感染创面炎症反应的调控机制，以及免疫细胞功能状态，尚未见深入的研究报道。
5 抗菌效果的改进随着对负压治疗机制认识的深入和材料学的不断发展，NPWT系统也在不断改进中。Ngo[15]发现NPWT结合载银敷料，可在24 h内迅速减少PA的数量。对比常规的NPWT，持续2周治疗，也无法达到相同的疗效；而单用载银敷料，也无法达到结合NPWT的治疗效果。Stinner等[33]采用羊腿复合创伤感染模型，也得到了同样的结果，而且验证该治疗方案对金黄色葡萄球菌也能产生显著作用。
另一种改进是NPWT结合消毒剂或抗生素治疗。Moch[34]使用聚乙烯醇海绵作为药物载体，对13例急性创面感染和14例慢性创面感染的患者进行治疗，取得较单纯NPWT更好的疗效。Rand等[35]使用了结合壳聚糖涂层的海绵敷料，作为抗生素的缓释载体，结果显著优于采用单一的NPWT治疗开放性骨折污染模型。其他学者使用体外模型观察NPWT联合应用不同类型消毒剂如1%聚维酮碘溶液、0.1%聚六亚甲基双胍、0.05%葡萄糖酸氯己定和抗生素如庆大霉素1 μg/mL、利福平24 μg/mL灌洗对成熟生物膜内的PA的影响，发现联合治疗组能够有效降低细菌数量，而单用消毒剂灌注冲洗组，对膜内细菌数量基本改变[18-19]。
现有研究表明NPWT应用载银敷料对慢性创面中PA具有显著杀伤作用，但在临床应用中还需要评估许多重要问题，例如患者的年龄，创面的部位，以及是否会导致毒性的累积。对于联合消毒剂或抗生素灌洗治疗的研究，研究结果存在着较大差异，诸如不同研究采用不同的菌属，不同的灌洗溶液，灌洗液在创面内停留的时间不同。目前对组织修复的影响程度及负压值调整标准等也尚未形成统一观点。
6 总结与展望负压创面疗法(negative pressure wound therapy，NPWT)以其独特的作用机理和不同于传统治疗的理念，已形成一套新的治疗方案。NPWT控制感染的机制尽管尚不完全明确，但大量研究表明能够有效减少PA的数量。同时，体外及动物实验支持NPWT能够压缩PA生物膜厚度和质量来改变生物膜结构，而间歇负压模式能够裂解其基质结构，需要进一步的临床实验证实。对于PA在负压作用下的毒力变化，仅有个别研究探索，却为PA细菌毒力研究拓展了思路。PA感染的炎症反应转归直接影响到组织是否能够修复再生，NPWT能够抑制慢性炎症反应并无明显争议，其作用途径值得深入探索。此外，对于NPWT联合其他抗菌治疗仍缺乏具体的临床应用性指导，包括如何选择合适的敷料、灌洗溶液的类型、最佳负压的设置及更换间隔等。对NPWT治疗铜绿假单胞菌感染创面机制原理的深入研究和阐释，使其在临床上得到更科学有效的应用，也为诸多基础研究拓展了方向。
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