肺癌是全球发病率和死亡率最高的疾病之一，患者确诊时多为晚期，预后差。目前肺癌的治疗手段主要包括外科手术、放疗、化疗、靶向治疗等，但常因耐药而复发。免疫治疗因为能诱导免疫记忆而产生持续的治疗应答，近年来受到广泛关注。

免疫组库（immune repertoire）是指机体中所有B淋巴细胞或T淋巴细胞的多态性总和，可以反映特定时段内机体免疫系统对外界刺激应答的能力^[1]。B细胞和T细胞表面的B细胞受体（B cell receptor, BCR）和T细胞受体（T cell receptor, TCR）上互补决定区（complementarity determining region, CDR）的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，构成容量巨大的TCR和BCR库，能与主要组织相容性复合体（MHC）-抗原肽分子进行特异性结合，从而高效、特异地杀伤靶目标^[2]。

人源TCR由二硫键连接而成的α/β异二聚体构成，除了跨膜区外，每条链均由恒定区（C区）和可变区（V区）两部分组成。α和β链的V区又有3个高变区，即CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3变异最大，是决定抗体特异性最重要的区域。受到抗原刺激后TCR的CDR可变（V）、多变（D）和连接（J）编码基因重排，体细胞高频突变，抗体类别转换等生理过程参与形成TCR多样性。T细胞通过识别与疾病相关的抗原而被特异性激活并扩增，从而导致TCR的分布出现差异。因此，对TCR组库的深入分析有助于了解患者的免疫反应。

T细胞与肿瘤的发生、进展、治疗反应密切相关。免疫识别的标志之一为肿瘤组织中T细胞浸润。肺癌治疗可引起患者外周血TCR免疫组库重建。在肿瘤部位识别TCR免疫组库，并重新激活功能失调的T细胞有望改善患者预后。本研究对5例肺癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）和胸腔积液单个核细胞（pleural effusion mononuclear cell, PEMC）的TCR免疫组库进行测序，分析其多样性，希望为临床治疗提供新的线索。

1 资料与方法 1.1 研究对象

纳入2020年7月至2021年1月在复旦大学附属中山医院接受诊治的5例合并恶性胸腔积液的肺癌患者，同期采集其外周血样本（n＝5）和胸腔积液样本（n＝5），建立TCR免疫组库。

1.2 PBMC分离及保存

使用EDTA抗凝管采集全血，取新鲜抗凝静脉血与无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）等体积充分混匀；在15 mL离心管中加入等血液体积的淋巴细胞分离液Ficoll；用移液器沿管壁缓慢将血液和PBS混合液叠加于Ficoll液面上，4℃ 400×g离心30 min。离心后可见管内分为3层：上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）为主的白色狭窄带。用移液器至云雾层吸取单个核细胞，置入50 mL离心管中，加入5倍以上体积的混有0.04%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的PBS，于4℃ 300×g离心8 min；弃上清，加入5 mL混有0.04% FBS的PBS重悬细胞，转入15 mL离心管中，于4℃ 300×g离心5 min；弃上清，留少量液体重悬细胞，将DMSO、FBS和细胞悬液按1∶4∶7的比例分别加入细胞冻存管中，混匀，标记好并梯度冻存后置于液氮中保存。

1.3 PEMC分离及保存

收集胸腔积液50 mL，于200×g离心10 min，弃上清，将DMSO和FBS按1∶9配比后重悬细胞，轻柔混匀至无细胞团块后梯度冻存。

1.4 TCR测序

抽提PBMC和PEMC的DNA用于TCR测序。TCR-β链的CDR3区域用特定的多重PCR引物（51V-前引物和14J-后引物）扩增以捕获所有可能的V(D)J组合。使用Illumina MiSeq平台建库，Trimmomatic对FASTQ文件进行质控，其中低质量碱基（得分＜20）被去除，同时用MiXCR进行检测并读取CDR3序列，并对CDR3序列和VDJ片段的克隆型进行定量。

1.5 TCR组库多样性分析

分别使用Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数（Evenness指数）进行TCR特征的多样性评估。Shannon指数兼顾TCR克隆种类的丰富度和每种克隆的均匀度，反映样本中TCR克隆的多样性，值越大表示TCR克隆的多样性越高^[3-4]。Simpson指数即在测得的克隆群中，连续2次抽样所得到的克隆属于同一种的概率，扩增克隆占比增大，则非扩增克隆占比减小，值越大表示克隆多样性越低^[5]。均匀度指数指克隆频率大于50%的所有克隆数目与克隆群中所有克隆数目的比值，反映克隆的均一程度；值越高表示克隆分布越均匀，值越低常表示一些特异性克隆发生了扩增^[6]。高扩增克隆（highly expanded clones, HEC）定义为大于总TCR库0.1%的克隆型。V或J利用率定义为某个特定V或J基因数量在所有V或J基因中的占比。高频克隆定义为在PBMC或PEMC中，存在于≥3个样本中的克隆。

1.6 统计学处理

使用R语言进行统计分析和图表呈现。组间定量资料的比较采用Student’s t检验，检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 肺癌患者PBMC与PEMC的TCR特征多样性及相关性分析

结果（图 1A~1C）显示，PBMC和PEMC中TCR克隆型、VJ配对基因、CDR3序列多样性差异均无统计学意义。结果（图 1D）显示，PBMC和PEMC中相关性由高到低的TCR特征依次为VJ配对基因（r_mean＝0.706，0.56~0.84）、克隆型（r_mean＝0.59，0.33~0.87）、CDR3序列（r_mean＝0.574，0.37~0.87）。

2.2 PBMC与PEMC的TCR特征数量

在肺癌患者的PBMC样本中共检测到888 868个特有克隆型（均值：178 778；中位数：175 072；极差：72 182~299 269)；在PEMC中共检测到229 542个特有克隆型（均值：46 443；中位数：14 747；极差：9 115~177 589）。PBMC与PEMC克隆型数量中位值，VJ配对基因和CDR3序列的数量差异无统计学意义（图 2A~2C）。

肺癌患者PBMC、PEMC样本共有克隆型、VJ配对基因和CDR3数量的均值分别是12 800、710和7 314。共有VJ配对基因的占比高于共有克隆型和CDR3序列（P＜0.01）；共有克隆型和共有CDR3序列的占比差异无统计学意义。共有克隆型数量在PEMC中总克隆型中的占比高于PBMC，但差异无统计学意义，共有VJ配对基因和CDR3序列在PBMC和PEMC中的占比相似（图 2D~2G）。

2.3 TCR克隆型特征分析

5个PBMC样本中无共有克隆型，有4个样本中共有克隆型10个；5个PEMC样本中有1个共有克隆型，即TRBV7-6:CASSLGGYEQYF: TRBJ2-7，该克隆存在于2个PBMC样本中；有4个PEMC样本共有克隆型8个（图 3A）。PBMC中平均有456个HEC（极差：307~949），PEMC中平均有1 450个HEC（极差：791~1 633），差异有统计学意义（P＝0.02，图 3B）。PBMC中HEC占比中位值是0.32（极差：0.16~0.70），PEMC中HEC占比中位值是0.78（极差：0.35~0.84），差异有统计学意义（P＝0.03，图 3C）。PBMC和PEMC中分别有246、156个高频克隆，共有高频克隆23个。

2.4 VJ配对基因分析

在患者PBMC和PEMC样本中共检测到28种V基因，PBMC和PEMC样本中V基因利用率差异无统计学意义（图 4A）；检测到2种J基因，分别为TRBJ1、TRBJ2，PBMC和PEMC中这2种J基因利用率差异无统计学意义（图 4B）；检测到36个表达量在PBMC和PEMC中有差异的VJ配对基因，其中9个在PEMC中减少（TRBV2TRBJ2-4、TRBV5-1TRBJ2-4、TRBV7-8TRBJ2-4、TRBV7-9TRBJ2-4、TRBV11-2TRBJ2-4、TRBV11-3TRBJ2-4、TRBV12-3TRBJ2-5、TRBV18TRBJ2-4和TRBV24-1TRBJ2-4，图 4C），余25个在PEMC中增加（图 4D）。

2.5 CDR3序列多态性

5例患者平均有7 314个CDR3序列（中位数：6 800，极差：4 546~10 206；图 5A）。出现频率大于90%的CDR3序列有36个，其中排前3位者为CASSLGGNQPQHF、CASSQAYEQYF、CASSPGGYEQYF序列（图 5B）。CASSLGGNQPQHF、CASSFQETQYF和CASSV序列在PEMC中的占比降低（P＜0.05，图 5C）。

3 讨论

TCR是T细胞特异性识别癌细胞突变的重要结构，可以启动机体对肿瘤的保护性免疫应答。TCR组库与肿瘤的分型、进展和治疗反应密切相关。有研究^[7]表明，在肺腺鳞癌患者中，与腺癌成分相比，鳞状细胞癌成分有更高的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）、更丰富的TCR克隆型和更低水平的TCR多样性。在肺鳞癌中，TCR多样性降低与促进支气管癌前病变消除的初始免疫应答相关^[8]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者PBMC中T细胞亚型的转化与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）应答反应延长相关。ICIs治疗后PBMC中记忆性CD8⁺T细胞扩增可使NSCLC患者获得更好的临床预后^[9]。NSCLC患者PBMC中PD-1⁺CD8⁺TCR多态性和克隆较高者接受ICIs治疗后可获得更好的疗效和更长的无进展生存期（progression-free survival, PFS）^[10]。而放疗增加黑素瘤小鼠癌旁T细胞TCR组库的多样性，两者协同治疗可增加黑素瘤患者临床获益^[11]。这些研究表明，与正常人受体库相比，TCR组库特征在以肺癌为代表的多种肿瘤中发生改变，且临床治疗可动态影响TCR组库的变化，提示TCR免疫组库在肺癌的临床诊断、指导用药、预后评估等中有广阔的应用前景。

本研究采用高通量测序技术对5例肺癌患者PBMC和PEMC的TCR免疫组库进行分析，发现PBMC和PEMC中克隆型、VJ配对基因和CDR3序列多样性相似，PBMC和PEMC的VJ配对基因相关性最高、CDR3序列的相关性最低，但差异无统计学意义。由此推测，肺癌患者的胸腔积液和外周血中T细胞免疫学特征相似。

TCR多样性可反映机体的免疫功能状况和健康程度。一般情况下，机体循环T细胞表面TCR均表现出多克隆状态，具有丰富的多样性，在特定抗原持续刺激或者疾病状态下，TCR多样性降低，优先调动的TCR亚家族呈现出寡克隆状态^[2]。本研究在PBMC样本中共检测到888 868个特有克隆型，在PEMC中共检测到229 542个特有克隆型，PBMC中特有克隆型数量的中位值高于PEMC（P＝0.06）；PBMC与PEMC中VJ配对基因和CDR3数量差异无统计学意义。本研究中，PBMC和PEMC样本VJ配对基因占比高于共有克隆型和CDR3序列，共有克隆型和共有CDR3序列占比差异无统计学意义；共有克隆型在PEMC中的占比高于PBMC（P＝0.06），共有VJ配对基因和CDR3序列在PBMC和PEMC中的占比差异无统计学意义。

人体细胞免疫系统主要依赖于TCR上的CDR与MHC-抗原肽分子特异性结合发挥作用。在TCR上的CDR中，CDR3多样性最高。本研究对5例肺癌患者PBMC、PEMC的CDR3序列进行分析，发现5例患者平均有7 314个CDR3序列，其中36个出现频率大于90%；有3种CDR3序列占比在PEMC中降低，分别为CASSLGGNQPQHF、CASSFQETQYF和CASSV。在5例患者的PBMC、PEMC样本中共检测到28种V基因和2种J基因，PBMC和PEMC样本中V基因利用率和J基因利用率差异均无统计学意义；有36个VJ配对基因表达量在PBMC和PEMC中差异明显，其中25个在PEMC中增加、9个在PEMC中减少，这为肺癌患者不同组织中免疫微环境差异化分析提供了新方向。有研究^[12-14]发现，在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征等自身免疫性疾病中，TCR克隆与疾病活动性、器官受累、临床特征及自身抗体密切相关。本研究发现，5例肺癌患者PEMC中HEC数量及占比均高于PBMC（P＜0.05），提示在肺癌进展中，胸腔积液TCR组库较外周血发生了更明显的偏斜，胸腔积液TCR组库可能具有更高的诊断价值。但是，PBMC中高频克隆的数量大于PEMC。

综上所述，肺癌患者外周血和胸腔积液的TCR组库表现出不同的特征性变化，其中胸腔积液TCR组库可能具有更高的诊断价值。TCR免疫组库分析为肺癌临床诊断、指导用药、免疫监测和预后评估提供了新的方法，对于理解该疾病的免疫病理学特征具有重要意义。有必要通过大样本量的前瞻性队列研究验证本研究结论，并深入分析TCR组库与肺癌进展及预后的相关性。

伦理声明  本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2017-142R），患者知情并签署知情同意书。

利益冲突  所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献  宋娟：样本收集与处理、数据分析和撰稿；王林林：样本收集与处理、数据分析；胡洁、宋元林：思路指导；童琳：资金支持、实验指导。