2023, Vol. 30
2. 南通大学附属医院神经外科, 南通 226000
2. Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu, China
自发性脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)发病率、致残率及致死率一直居高不下[1]。欧美发达国家ICH发病率占卒中的10%~15%，而亚洲国家ICH发病率占卒中的20%~30%[2]。ICH患者1年死亡率(59%)远高于缺血性卒中患者(14%)。随着人口老龄化发展以及抗凝、抗血小板药物应用增加，ICH的发病率呈明显升高趋势[3]。
ICH发生后，可导致血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)被破坏及血管源性脑水肿，并促进白细胞、凝血酶原和补体等进入大脑，继发脑损伤[4-5]。ICH等急性脑损伤会引起复杂的免疫和炎症级联反应[6]，导致患者外周血中细胞和分子免疫系统变化。目前，有关ICH患者免疫改变与其预后之间关系的研究较少。因此，本研究进一步观察ICH患者外周血中的细胞和分子免疫变化，并探讨这些变化与患者神经功能的相关性。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择南通市第三人民医院神经外科2022年1月至12月收治的自发性ICH患者25例，另选择与ICH患者年龄相匹配的在该院体检中心进行健康体检者30名作为对照。纳入标准：(1)经CT证实为自发性ICH，符合中国脑出血诊治指南(2019版)诊治标准；(2)患者年龄在18周岁以上；(3)进行颅脑血肿清除术；(4)入院格拉斯哥昏迷指数(GCS)≥6分。排除标准：(1)合并恶性肿瘤患者；(2)继发性ICH患者；(3)凝血功能障碍患者；(4)心、肺、肝、肾等器官严重功能障碍患者；(5)有严重临床感染病史；(6)有卒中病史，并伴有神经功能障碍；(7)接受免疫治疗。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，获得南通市第三人民医院伦理委员会批准(E2021003)，所有患者均签署知情同意书。
1.2 观察指标ICH患者在入院时接受GCS评分评估；发病90 d后采用改良Rankin量表进行神经功能评分。ICH发病90 d mRS≤3分为预后良好；mRS≥4分为预后不良。
患者入院后6 h内，采集外周血10 mL，采用ELISA试剂盒(sigma公司)检测肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)和细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ)，用酶标仪读取波长450 nm处吸光度(D值)。
采用流式细胞仪(BD FACSCalibur)分析，所用抗体均购自Biolegend公司。患者入院后6 h内，采集外周血10 mL，经红细胞裂解液处理，(400~500)×g离心5 min，去除上清，用PBS悬浮细胞；加入T细胞(CD3+)、CD4+T细胞(CD3+CD4+)，CD8+T细胞(CD3+CD8+)、B细胞(CD3－CD19+)、NK细胞(CD3－CD16－CD56－)相应抗体室温避光孵育20 min；500×g离心5 min，PBS洗涤细胞，离心，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。采用FlowJo软件分析各细胞计数。
1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 9对实验数据进行处理和分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性、方差齐性分析，计量资料均符合正态分布，以x±s表示，进行t检验。分类变量以n(%)表示，进行卡方检验。采用Pearson相关系数评估患者GCS评分、出血量与各免疫指标之间的相关性。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 患者基线资料ICH组高血压患者比例明显高于健康对照组(P＝0.000 1，表 1)。ICH组患者发病至入院时间(14.28±16.03)h，基底节区出血12例(48%)、其他13例(52%)，GCS评分(12.44±2.50)分，出血量(22.74±20.22)mL。
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | 健康对照组(n＝30) | ICH组(n＝25) | P值 | ||||||||||||||||||||||||||
| 年龄/岁 | 62.23±2.99 | 64.44±12.65 | 0.367 9 | ||||||||||||||||||||||||||
| 男性 | 14(46.67) | 17(68.00) | 0.112 2 | ||||||||||||||||||||||||||
| 高血压 | 4(13.33) | 16(64.00) | 0.000 1 | ||||||||||||||||||||||||||
| 糖尿病 | 3(10.00) | 5(20.00) | 0.294 9 | ||||||||||||||||||||||||||
| 高脂血症 | 10(33.33) | 9(36.00) | 0.835 9 | ||||||||||||||||||||||||||
| 服用阿司匹林史 | 5(16.67) | 6(24.00) | 0.498 4 | ||||||||||||||||||||||||||
| 服用他汀类药物史 | 4(13.33) | 6(24.00) | 0.307 1 | ||||||||||||||||||||||||||
ELISA结果(图 1)显示：两组外周血中ACTH和CORT水平多正常，差异无统计学意义。
|
| 图 1 ELISA检测两组外周血激素、细胞因子水平 **P＜0.01。 |
ELISA结果(图 1)显示：两组外周血中IL-2、IL-17A和IFN-γ差异无统计学意义；ICH组患者外周血中IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α水平高于健康对照组(P＜0.01)。
2.2.3 免疫细胞流式分析结果(图 2)显示：与健康对照组相比，ICH组患者外周血中白细胞计数增加(P＜0.001)，单核细胞、中性粒细胞和NK细胞计数增加(P＜0.01)，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞计数减少(P＜0.001)；两组嗜碱性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞计数差异无统计学意义。
|
| 图 2 流式细胞仪检测两组患者外周血免疫细胞含量 **P＜0.01, ***P＜0.001。 |
Pearson相关性分析(表 2)显示：GCS评分与IL-17A有一定负相关关系(r＝﹣0.493 2，P＝0.012)；出血量与IL-4有一定正相关关系(r＝0.479 5，P＝0.015)。
| 参数 | IL-2 | IL-4 | IL-6 | IL-10 | IL-17A | TNF-α | IFN-γ |
| GCS评分 | |||||||
| r值 | 0.036 4 | ﹣0.359 9 | ﹣0.043 9 | ﹣0.217 2 | ﹣0.493 2 | ﹣0.176 4 | ﹣0.063 5 |
| P值 | 0.863 0 | 0.077 2 | 0.835 0 | 0.297 0 | 0.0120 | 0.399 0 | 0.763 1 |
| 出血量 | |||||||
| r值 | ﹣0.021 0 | 0.479 5 | 0.208 2 | 0.312 1 | 0.357 0 | 0.204 1 | 0.064 8 |
| P值 | 0.920 5 | 0.015 0 | 0.317 9 | 0.128 8 | 0.079 8 | 0.327 8 | 0.758 2 |
Pearson相关性分析(表 3)显示：GCS评分与单核细胞计数有一定负相关关系(r＝﹣0.533 8，P＝0.006)；出血量与白细胞计数(r＝0.509 2，P＝0.009)和单核细胞计数(r＝0.5758，P＝0.002 6)有一定正相关关系。
| 参数 | 白细胞计数 | 淋巴细胞计数 | 单核细胞计数 | 中性粒细胞计数 | 嗜酸性粒细胞计数 | 嗜碱粒细胞计数 |
| GCS | ||||||
| r值 | ﹣0.30 4 | 0.141 1 | ﹣0.533 8 | ﹣0.212 6 | ﹣0.188 4 | 0.331 5 |
| P值 | 0.139 6 | 0.501 2 | 0.006 0 | 0.307 7 | 0.367 1 | 0.105 4 |
| 出血量 | ||||||
| r值 | 0.509 2 | ﹣0.210 9 | 0.575 8 | 0.456 7 | 0.348 7 | ﹣0.451 3 |
| P值 | 0.009 0 | 0.311 6 | 0.002 6 | 0.021 7 | 0.087 5 | 0.023 5 |
ICH患者中，发病90 d mRS≤3分者18例(72%，预后良好组)，mRS≥4分7例(28%，预后不良组)。结果(表 4)显示：预后良好组高血压患者比例小于预后不良组(P＝0.026 7)，入院GCS评分大于预后不良组(P＝0.018 8)。
| 指标 | 预后良好(n＝18) | 预后不良(n＝7) | P值 |
| 年龄/岁 | 61.78±12.83 | 71.29±11.15 | 0.367 9 |
| 男性n(%) | 12(66.67) | 5(71.43) | 1.000 0 |
| 高血压n(%) | 9(50.00) | 7(100.00) | 0.026 7 |
| 糖尿病n(%) | 4(22.22) | 1(14.29) | 1.000 0 |
| 入院时间/h | 14.94±16.73 | 12.57±16.52 | 0.752 3 |
| 基底节区出血n(%) | 9(50.00) | 3(42.86) | 1.000 0 |
| GCS评分 | 13.17±1.69 | 10.57±3.51 | 0.018 8 |
| 出血量/mL | 18.33±12.66 | 31.14±31.79 | 0.154 8 |
结果(图 3)显示：ICH预后良好组与预后不良组患者外周血中细胞因子、免疫细胞水平差异均无统计学意义。
|
| 图 3 预后良好组与预后不良组细胞因子水平和免疫细胞水平的比较 |
细胞因子常由活化的淋巴细胞和巨噬细胞产生[7]。根据细胞因子在炎症反应中的作用，分为抗炎型和促炎型。ICH发生后，大量细胞因子释放并积聚在脑组织中，参与损伤和修复过程[8]。促炎细胞因子会损害血脑屏障，加剧脑水肿，并使小胶质细胞向M1型分化[8-9]；抗炎细胞因子，如TGF-β和IL-10，促使小胶质细胞向M2型分化，促进血肿和组织碎片的清除，同时降低促炎细胞因子水平，并有助于组织修复[10]。其中，IL-6具有促炎及抗炎的双重特性[11]。有研究[9]显示，外周血中IL-11、IL-10和IL-6水平与ICH严重程度相关。本研究中，ICH组患者外周血中IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α水平升高(P＜0.01)，与上述研究结果相似；且GCS评分与IL-17A负相关，出血量与IL-4正相关，表明细胞因子变化可提示患者病情的严重程度。
白细胞、淋巴细胞、单核细胞等通过破坏BBB完整性、免疫反应、促进血肿周围水肿形成等导致ICH病情加重[5, 12-13]。本研究中，ICH组患者外周血中白细胞、单核细胞、中性粒细胞和NK细胞计数增加，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞计数减少(P＜0.01)；GCS评分与单核细胞计数负相关，出血量与白细胞及单核细胞计数正相关(P＜0.01)。但是，本研究未发现ICH预后良好组与不良组细胞因子及免疫细胞水平的差异。
原发性ICH常由高血压或脑淀粉样血管病等引起[14]；继发性ICH常由血管畸形、血液病、凝血病、烟雾病、静脉窦血栓形成、药物不良反应或缺血性梗死转化而来[15]。高血压也是ICH的重要致病因素，65%的自发性ICH由高血压引发[16-17]。高血压与ICH不良预后相关，降低血压是改善ICH预后的重要路径。本研究，ICH预后不良组患者均有高血压病史，患者比例大于预后良好组。此外，缺血性脑卒中患者生长激素、CORT、ACTH和甲状腺激素水平改变[18]。本研究中，ICH患者外周血中CORT、ACTH与健康对照组相似，可能原因为本研究样本量小，且患者出血量少使CORT和ACTH激素水平明显不变化。
综上所述，本研究显示免疫细胞和细胞因子参与神经炎症过程，与神经功能受损相关。但本研究样本量小，导致研究局限性较大，可能是ICH预后良好组与不良组免疫改变无差异的原因；仅有ICH急性期(ICH发病后6 h内)细胞因子水平和免疫细胞监测数据，无法确定峰值；而且未能证实细胞因子水平和免疫细胞与患者预后的关系。须增加样本量进一步验证本研究结论，并进一步探讨ICH患者外周血免疫改变对其预后的影响。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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