2023, Vol. 30
2. 复旦大学附属中山医院骨科, 上海 200032
2. Department of Orthopedic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
骨转移是恶性肿瘤终末期常发生的病理过程之一，尤其是肺癌、乳腺癌；超过70%的终末期恶性肿瘤患者会并发骨转移[1-2]。一旦恶性肿瘤发生骨转移，会产生一系列骨骼相关不良事件，如疼痛、病理性骨折等，严重时可能导致瘫痪，降低患者生活质量[3-4]。
外泌体是一种直径40~100 nm的囊泡结构，内含丰富的蛋白质、RNA等活性成分。研究[5]证实，外泌体可介导多种生物信息交流，例如细胞间的信息传递等。肿瘤细胞可通过外泌体与癌旁组织细胞进行信息交流，促进血管新生，增强其侵袭、增殖、转移能力等[6]。破骨细胞源性外泌体携带有调控功能的微小RNA（microRNA，miRNA），在骨微环境中调节成骨分化、溶骨等重要功能，逐渐成为研究热点[7]。
miRNA在调控肿瘤发生、发展及转移中发挥重要作用。研究[8]发现，外泌体可以携带大量miRNA，影响靶基因表达，从而起到信息传递作用。miR-183-5p作为一种多功能miRNA，在肿瘤侵袭、转移方面具有重要的调控作用[9]。但是，关于miR-183-5p在肺腺癌骨转移过程中的功能及作用机制研究较少。本研究通过探讨破骨细胞外泌体来源miR-183-5p对肺腺癌细胞的生物学调控作用及其分子机制，为肺腺癌骨转移的治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂、仪器及细胞系DMEM培养基购自上海凯基生物技术有限公司；程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4, PDCD4）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1, CCND1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）等抗体购自美国CST公司；qRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司提供；巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）购自美国R & D公司；RIPA Buffer、蛋白酶抑制剂PMSF购自碧云天生物技术有限公司；JEM-1400 Plus透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）购自日本HITACHI公司；RAW264.7和A549细胞系购自中国科学院细胞库。
1.2 破骨细胞的诱导及TRAP染色RAW264.7细胞系以5 000个/孔均匀接种于48孔板，每孔加入500 µL完全培养基，以核因子κB受体激活剂配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL；20 ng/mL）诱导其分化，隔天换液，使用显微镜观察多核融合的巨细胞形态。诱导分化结束后，弃培养基，PBS清洗2次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，0.1% Triton-100处理；加入TRAP染色液，室温孵育1 h，使用显微镜观察细胞形态。
1.3 破骨细胞来源外泌体提取、鉴定RAW264.7诱导破骨细胞分化成功后，使用含10%胎牛血清（不含外泌体）的DMEM培养基培养48 h，收集、过滤其培养液。4℃条件下以300×g离心10 min，去除细胞碎片，0.22 µm滤器过滤，取上清液；在同样条件下分别以2 000×g、10 000×g离心20 min、30 min，过滤取上清液；以100 000×g离心120 min，弃上清液，收集沉淀（外泌体）。将沉淀重悬于100 µL预冷的PBS液内，TEM观察外泌体形态，通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）检测其粒径分布。
1.4 破骨细胞外泌体与肺腺癌细胞共培养用细胞膜绿色荧光探针标记外泌体进行孵育染色，然后取对数生长期A549细胞，消化离心后重悬于不含血清的DMEM培养基。提前将盖玻片置入48孔板底部，分别计数104个细胞，均匀接种后进行细胞爬片，放入37℃、含5% CO2培养箱培养；待细胞贴壁后分别加入5 µL外泌体，培养24 h，再进行细胞核Hoechst染色；取出盖玻片，PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛进行固定、封片，共聚焦显微镜观察外泌体被摄取情况。另取部分最终质量浓度为20 μg/mL的外泌体悬液培养A549细胞48 h，用于后续实验。
1.5 qRT-PCR检测miR-183-5p表达将与外泌体共培养的A549细胞以及正常培养的A549细胞加入TRIzol试剂，充分混匀裂解并提取总RNA，以A260/A280比值验证RNA纯度。配制RNA反转录体系获得cDNA，根据SYBR Green试剂盒的操作说明书建立稳定反应体系，进行cDNA模板扩增。以U6作为内参，2﹣ΔΔCt表示目的基因相对表达量。各基因引物序列见表 1。
| 基因 | F (5'-3') | R (5'-3') |
| miR-183-5p | CGCGGTATGGCACTGGTAGA | AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC |
| U6 | CTCGCTTCGGCAGCACA | AACGCTTCACGAAYYYGCGT |
将共培养后的A549细胞均匀接种于6孔板，待细胞长满孔板底部，用无菌移液枪的枪头（10 µL）垂直于孔板底部划痕。PBS轻轻清洗1次，即刻（0 h）用显微镜拍照记录，并分别于24 h、48 h及72 h以PBS轻轻冲洗培养板后，用显微镜拍照记录。
1.7 Transwell实验预先在Transwell小室基底均匀铺上基质胶，取约3×104个消化、离心后共培养后的A549细胞加至Transwell上室，将800 µL完全培养基加入下室，恒温培养48 h。取出上室并弃去其中培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色5 min，擦拭去除小室内侧细胞。使用显微镜观察，随机选取6~8个视野，计数染色的肿瘤细胞。
1.8 CCK-8检测A549细胞活性采用CCK-8试剂盒检测共培养A549细胞增殖情况：取对数生长期A549细胞共培养后，按照每孔103个细胞均匀接种于96孔板，24 h、48 h及72 h时，在相应孔中分别加入CCK-8试剂10 µL，恒温箱孵育2 h，多功能酶标仪检测细胞在荧光强度450 nm的光密度（D）值。
1.9 细胞周期与凋亡检测将转染后的A549细胞分别接种于6孔板，培养48 h，胰酶消化、离心，预冷PBS清洗，以1 000×g离心5 min，弃上清液，预冷75%乙醇固定过夜。将固定过夜的细胞离心，PBS清洗1次，加入400 µL溴化乙锭（PI）、100 µL RNase A重悬细胞，混匀，避光放置20~30 min。上机进行细胞周期分析，根据Annexin V-APC/7-AAD试剂盒说明书检测细胞凋亡率。
1.10 Western印迹检测miR-183-5p靶蛋白相对表达量预冷RIPA、PMSF混合裂解液（体积比100∶1），加入与外泌体共培养24 h、48 h、72 h的A549细胞对其进行裂解。在4℃环境以12 000×g离心15 min提取细胞总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。配制分离、浓缩胶，依次进行蛋白质样品电泳、转膜，4℃封闭过夜；加一抗PDCD4（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、CCND1（1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜，室温下二抗孵育2 h；显影，检测蛋白表达水平。
1.11 统计学处理每组实验均重复3次。采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用t检验进行两组间比较，单因素方差分析进行多组间比较，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 破骨细胞TRAP染色与外泌体鉴定将RAW264.7向破骨细胞诱导分化完全后，进行TRAP染色，发现酒红色椭圆形多核巨细胞（图 1A）。TEM扫描见破骨细胞来源外泌体为边界清晰的圆形或椭圆形囊泡结构（图 1B）；纳米颗粒跟踪检测发现，囊泡粒径为30~200 nm（图 1C），符合外泌体粒径范围。
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| 图 1 破骨细胞来源外泌体的鉴定 A：破骨细胞TRAP染色（×100）；B：透射电子显微镜观察外泌体形态（×10 000）；C：动态光散射检测外泌体直径分布。 |
将外泌体加入A549细胞共培养，荧光探针显示外泌体与A549融合（图 2A）；共聚焦显微镜发现外泌体被A549细胞摄入（图 2B）。共培养48 h后，qRT-PCR检测（图 2C）显示，共培养A549细胞中miR-183-5p表达水平高于正常A549细胞（P＜0.01）。
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| 图 2 共培养后A549细胞摄取外泌体 A：荧光显微镜下外泌体被摄取形态(×40)；B：共聚焦显微镜下外泌体被摄取形态(×500)；C：正常A549细胞和外泌体共培养后A549细胞miR-183-5p表达比较。n＝3，x±s，**P＜0.01。 |
划痕实验（图 3A）表明，共培养72 h时，A549细胞迁移能力较共培养24 h时提高（P＜0.01）；Transwell实验（图 3B）表明，共培养48 h和72 h时，A549细胞侵袭能力较共培养24 h时提高（P＜0.01）。
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| 图 3 破骨细胞来源外泌体对A549细胞迁移、侵袭的影响 A：划痕实验(×40)；B：Transwell实验(×40)。n＝3，x±s，**P＜0.01与24 h时相比。 |
CCK-8实验（图 4A）显示，共培养48 h、72 h时的A549细胞活性高于正常A549细胞（P＜0.01）。与正常A549细胞相比，处于DNA合成期（S期）的共培养A549细胞数量增多（P＜0.05，图 4B）、凋亡率下降（P＜0.05，图 4C）。
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| 图 4 破骨细胞来源外泌体对A549细胞增殖活性及凋亡的作用 A：CCK-8检测外泌体对A549细胞活性的影响；B、C：AnnexinⅤ/PI检测外泌体对A549细胞周期及凋亡的影响。n＝3，x±s；*P＜0.05、**P＜0.01与A549单独培养时相比。 |
Western印迹法（图 5）显示，A549细胞中miR-183-5p过表达48 h后，PDCD4表达降低，CCND1、CDK4表达增加（P＜0.05）；过表达72 h后靶蛋白表达进一步改变（P＜0.05）。
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| 图 5 破骨细胞来源外泌体对A549细胞中miR-183-5p靶蛋白PDCD4、CCND1、CDK4表达的影响 n＝3，x±s；*P＜0.05与24 h时相比，△P＜0.05与48 h时相比。 |
肺癌已成为全球发病率及致死率最高的恶性肿瘤，尤其易发生骨转移[10]。近年来，转移前微环境（pre-metastatic niche, PMN）被认为是恶性肿瘤转移的重要因素之一；骨转移微环境有利于肿瘤细胞定植，进而导致骨转移[11]。Yuan等[12]发现，外泌体以囊泡形式被靶细胞摄取，将其内部物质与靶细胞融合，形成有利于肿瘤定植的局部微环境。在骨转移微环境中，破骨细胞来源的外泌体通过旁分泌进入肿瘤细胞，通过调控肿瘤细胞的靶基因信号通路干预骨转移进程。破骨细胞调控肿瘤骨转移机制近期成为研究热点。He等[13]发现，肺癌细胞诱导破骨细胞分泌IL-20RB配体IL-19，激活下游JAK1/STAT3信号通路，导致骨内肿瘤细胞增殖增强。肝癌细胞源性外泌体miR-574-5p通过调节骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2, BMP-2）促进破骨细胞生成，产生病理性溶骨，从而导致骨转移[14]。
本研究将RAW264.7细胞诱导向破骨细胞完全分化，提取破骨细胞外泌体，并经电镜证实形态、结构、粒径均符合既往文献[7]报道。将外泌体与肺腺癌细胞共培养，发现外泌体能被肺腺癌细胞摄入，这为外泌体发挥信息传递作用的基础。文献[15-16]证实，破骨细胞源性外泌体内含miRNA，其中miR-183-5p含量较为丰富，且与肿瘤转移关系密切。本研究发现共培养后的A549细胞中miR-183-5p高表达，可见外泌体包含的miR-183-5p可进入A549细胞；共培养的A549细胞增殖、迁移和侵袭能力增高，提示破骨细胞外泌体来源的miR-183-5p可促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。
PDCD4是重要的抑癌基因之一，表达缺失会引起肿瘤的发生及发展。本研究中，共培养A549细胞中PDCD4表达降低，提示PDCD4为miR-183-5p的下游靶基因之一，与既往文献[17]结果一致。本研究流式结果显示，共培养促进A549细胞进入分裂期（S期），同时抑制其凋亡，这一结果可能与miR-183-5p抑制PDCD4表达、促进CCND1和CDK4表达有关。
综上所述，本研究表明，破骨细胞外泌体共培养可促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，可能通过miR-183-5p靶向抑制PDCD4等发挥作用。本研究为临床治疗肿瘤骨转移提供了新思路。由于破骨细胞来源外泌体内容物较复杂，同时本研究不能直接证实miR-183-5p过表达对A549细胞的影响，因此结论及相关分子机制须进一步探讨。
利益冲突： 所有作者声明不存在利益冲突。
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