2023, Vol. 30
2. 江南大学附属妇产医院病理科, 无锡 214002;
3. 江南大学附属妇产医院乳腺科, 无锡 214002
2. Department of Pathology, Wuxi Maternal and Child Health Hospital, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214002, Jiangsu, China;
3. Department of Breast Surgery, Wuxi Maternal and Child Health Hospital, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214002, Jiangsu, China
早期宫颈癌患者盆腔未发现转移淋巴结时，其5年生存率可达83.7%；发现转移时，其5年生存率降至约67.6%[1]。目前国内参照美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）乳腺癌TNM分期第8版腋窝淋巴结转移标准评估淋巴结转移：淋巴结内肿瘤病灶＞2.0 mm为宏转移（macrometastasis，MC）；淋巴结内肿瘤病灶最大径≤2.0 mm为微转移（micrometastasis, MM）；单个细胞或小细胞簇最大径≤0.2 mm为孤立肿瘤细胞（isolated tumor cells, ITC）[2]。早期宫颈癌患者中，即使常规病理检查未发现淋巴转移，仍有10%~15%出现病灶复发或转移，可能与常规病理学检测难以发现MM和ITC有关[3]。
2023 NCCN指南推荐将前哨淋巴结活检技术（sentinel lymph node biopsy, SLNB）应用于Ⅰ期和部分ⅡA期（最大径≤2.0 cm）早期宫颈癌患者的盆腔淋巴结评估，以减少系统盆腔淋巴结清扫（pelvic lymphadenectomy, PLA）带来的并发症[4]。目前SLNB术中可快速进行细胞学[如印片细胞学（touch imprint cytology, TIC）]、病理形态学[如冰冻切片（frozen section, FS）]、分子生物学诊断[如反转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）]。目前，国内多采用TIC和FS，但二者对MM及ITC灵敏度均欠佳[5-6]。多层连续切片和免疫组化（IHC）可提高诊断准确率，但术中难以完成[7]。
一步核酸扩增（one-step nucleic acid amplification，OSNA）可用30~40 min测得CK19 mRNA在淋巴结匀浆液内的表达量，进而有助于界定MC、MM及ITC。OSNA已广泛用于乳腺癌前哨淋巴结（sentinel lymph node, SLN）转移术中诊断[8-9]，但诊断宫颈癌SLN转移的效果研究较少。因此，本研究以术后病理结果为金标准，评估OSNA应用于宫颈癌SLN转移的价值，并与FS相关结果相比较。
1 资料与方法 1.1 一般资料前瞻性纳入2020年10月至2022年3月在江南大学附属妇产医院妇瘤科诊治的早期宫颈癌患者68例。纳入标准：（1）FIGO 2018分期ⅠA1期伴淋巴脉管间隙浸润（lymph vascular space invasion, LVSI）至ⅡA2期；（2）接受SLNB，包括术中OSNA、FS检测和术后病理检测。排除接受过新辅助化疗，以及术前接受或选择放射治疗患者。收集患者肿瘤大小、组织学类型、FIGO分期、子宫颈浸润状况、淋巴脉管浸润状况。本研究获得医院伦委会批准（2020-01-0429-10），患者知情并签署知情同意书。
1.2 SLNB方法宫颈注射亚甲蓝（北京永康药业有限公司，图 1）后，进行SLNB：将获取的SLN样本于3 min内，按其质量及短轴长度以2~3 mm切分，相间隔进行OSNA（试剂盒购自日本希森美康公司）和FS，余组织用于术后超分期联合IHC检测。行SLNB后，进一步行系统PLA，SLN与nSLN分别标记送检。
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| 图 1 腹腔镜下宫颈鳞癌左侧盆腔前哨淋巴结亚甲蓝染色 |
将长轴≥5 mm SLN样本以2~3 mm切分后，部分切片进行OSNA（淋巴结长轴＜5 mm或淋巴结总质量＜100 mg时，不进行OSNA）：将淋巴结至冰上匀浆，加入样本处理液（Lynorhag）提取RNA。应用CK19 mRNA检测试剂盒（Lynoamp BC）及基因扩增分析仪RD-100i（日本希森美康公司）检测CK19 mRNA浓度：分别加入CK19引物溶液20 μL、酶溶液3 μL和待测样本2 μL至皿中混匀，升温至65℃，在65℃环境下反应16 min，检测D465（反映检测皿中反应液的浊度）。测定从升温开始至浊度超过规定阈值的时间（反应时间）。根据校准品1低值、校准品2中值及校准品3高值作为测定样本时的反应生成时间及标准品CK19 mRNA浓度，计算待测样本、稀释样本中CK19 mRNA的浓度。1次OSNA可以分析4个淋巴结。结果判读：++表示CK19 mRNA拷贝数＞5 000个/μL；+表示CK19 mRNA拷贝数250~5 000个/μL；－表示CK19 mRNA拷贝数＜250个/μL。
1.2.2 H-E染色FS和术后超分期采用H-E染色。FS检测中H-E染色：术中获取SLN标本后，剔除脂肪血管结缔组织，取蓝染淋巴结，快速冷冻固定，以5 μm厚度切片，苏木精染色，1%盐酸乙醇醇化，1%氨水返蓝，伊红染色，镜下读片诊断。超分期H-E染色：SLN标本以50 μm间隔、5 μm厚度逐层切片（n＝3）后，进行H-E染色后镜下观察。依据第8版AJCC肿瘤分期标准[2]判读结果：转移灶最大径＞2.0 mm为MC，0.2~2.0 mm为MM，＜0.2 mm为ITC。
1.2.3 IHC对术后超分期结果不明确的SLN，采用罗氏全自动免疫组织化学染色机（型号：BenchMark XT）进行IHC：SLN标本剔除脂肪血管结缔组织，暴露淋巴结，10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，脱蜡水化，抗原修复，封闭；滴加CK19 AE1/AE3（1∶200）一抗孵育过夜；滴加HRP标记的二抗室温孵育60 min，采用DAB显色。用苏木精复染，脱水，二甲苯浸泡，封片，镜下读片。
1.3 SLN阳性评估SLN阳性判断标准：（1）H-E染色示细胞核大深染，核质比失调，有异型性；（2）IHC染色阳性。由2名病理科高级职称医师采用双盲法阅片，依据第8版AJCC肿瘤分期标准评估。当OSNA为阴性、IHC为阳性时，余组织再次行OSNA。同一患者的2个或2个以上SLN的OSNA检测结果不同时，取阳性或拷贝数最高的结果。
1.4 统计学处理采用SPSS 22.0进行统计分析。以术后H-E染色联合IHC结果为金标准，评估OSNA检测的准确度、特异度、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值。阳性率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kappa指标评估OSNA、FS与术后病理结果之间的一致性：Kappa值≥0.75时，表明两者一致性较好；0.75＞Kappa值≥0.4时，表明两者一致性一般；Kappa值＜0.4时，表明两者一致性较差。所有检验均为双侧，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 患者一般临床病理特征68例患者年龄28~72岁，≤50岁31例（45.6%）、＞50岁37例（54.4%）。其中，鳞癌46例（67.6%）、腺癌13例（19.1%）、腺鳞癌5例（7.4%）、透明细胞癌3例（4.4%）、未分化小细胞癌1例（1.5%）；2018 FIGO分期Ⅰ期49例（72.1%）、Ⅱ期19例（27.9%）；子宫颈间质浸润深度＜50%者42例（61.8%）、≥50%者26例（38.2%）；LVSI阳性21例（30.9%）、阴性47例（69.1%）。
2.2 OSNA、术中FS、术后病理检出SLN情况及效能比较 2.2.1 SLN检出情况68例患者术中成功检出130枚SLN，单侧13例（19.1%）、双侧55例（80.9%）；检出2枚者43例（63.2%）、检出1枚者22例（32.4%）、检出2枚以上者3例（4.4%），平均检出1.9枚。结果（表 1）显示：术后病理检出SLN阳性26枚（20.0%），其中13枚为MC、13枚为MM。OSNA检出SLN阳性29枚（22.3%），其中13枚为MC、16枚为MM，4枚术后病理检测示阴性；101枚OSNA检测阴性的SLN中，1枚术后病理检测示MM。术中FS检出SLN阳性16枚，其中13枚为MC、3枚为MM；114枚FS检测阴性的SLN中，10枚术后病理检测示MM。
| n＝130 | |||||||||||||||||||||||||||||
| OSNA | 术后病理 | FS | 术后病理 | ||||||||||||||||||||||||||
| 宏转移 | 微转移 | 阴性 | 合计 | 宏转移 | 微转移 | 阴性 | 合计 | ||||||||||||||||||||||
| 阳性 | 13 | 12 | 4 | 29 | 阳性 | 13 | 3 | 0 | 16 | ||||||||||||||||||||
| 阴性 | 0 | 1 | 100 | 101 | 阴性 | 0 | 10 | 104 | 114 | ||||||||||||||||||||
| 合计 | 13 | 13 | 104 | 130 | 合计 | 13 | 3 | 104 | 130 | ||||||||||||||||||||
OSNA检出SLN的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为96.2%、96.2%、86.2%、99.0%（P＝0.375），与术后病理结果一致性较好（Kappa值＝0.885）。FS检出SLN的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为61.5%、100%、100%、91.2%（P＝0.002），与术后病理结果一致性一般（Kappa值＝0.719）。
2.2.3 OSNA与FS检出SLN转移的灵敏度比较OSNA检出MC、MM的灵敏度分别为100%、92.3%；FS检出MC、MM的灵敏度分别为100%、23.1%。OSNA检出MM的灵敏度优于FS（P＝0.030）。
2.3 OSNA与术后病理检出SLN转移的一致性分析130枚SLN中，109枚术后H-E染色示阴性，经IHC检出5枚小体积肿瘤转移灶，其中3枚为MM、2枚为ITC；1例术中一半淋巴结OSNA检测结果与IHC检测结果高度相符（图 2）。
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| 图 2 1例患者SLN的ITC与MM的OSNA及IHC检测结果 患者46岁，检出SLN阳性2枚，OSNA检出2枚、术后病理检出2枚。A：ITC，CK19拷贝数＜250个/μL，与IHC结果一致；B：MM，CK19拷贝数为2 700个/μL，与IHC检测结果一致。 |
另5例患者OSNA检测结果与术后IHC不一致（表 2）。该5例患者均仅经OSNA检测1枚SLN，其中，4枚SLN OSNA阳性、IHC阴性，1枚SLN OSNA阴性、IHC阳性。
| 项目 | 患者1 | 患者2 | 患者3 | 患者4 | 患者5 |
| 年龄/岁 | 46 | 40 | 28 | 48 | 49 |
| 病理类型 | 腺癌 | 腺癌 | 腺癌 | 腺癌 | 小细胞癌 |
| 分化程度 | 低 | 中 | 中 | 中 | 未分化 |
| FIGO分期 | ⅠA2 | ⅠA2 | ⅠB1 | ⅠB2 | ⅠB2 |
| 子宫颈间质浸润深度 | ＜50% | ＞50% | ≥50% | ＜50 | ＜50% |
| CK19 mRNA拷贝数/(个·μL﹣1) | ＜250 | 1 200 | 3 600 | 2 100 | 2 700 |
| 免疫组化 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 辅助治疗 | — | — | 化疗+放疗 | 化疗 | 化疗 |
| 复发时间/月 | — | 12 | — | — | — |
| 随访时间/月 | 26 | 12 | 19 | 15 | 6 |
OSNA检出SLN阳性患者25例，其中16例（64.0%）nSLN为阴性。16例阴性nSLN患者中，OSNA检出1枚SLN阳性者11例（62.5%），OSNA检出1枚以上阳性SLN者5例（37.8%）；9例阳性nSLN患者中，OSNA检出1枚阳性SLN者2例（22.2%），检出1枚以上阳性SLN者7例（77.8%），OSNA检出1枚以上阳性SLN患者比例更高（P＝0.041，表 3）。
结果（表 4）显示：OSNA检出SLN阳性组与阴性组SLN肿瘤细胞分化、Ki67表达及LVSI情况差异有统计学意义（P＜0.05）。
| 特征 | 阴性（n＝101） | 阳性（n＝29） | P值 |
| 肿瘤细胞分化 | 0.010 | ||
| G1 | 36 | 3 | |
| G2 | 46 | 15 | |
| G3 | 19 | 11 | |
| Ki67 | 0.020 | ||
| 低表达 | 54 | 6 | |
| 高表达 | 47 | 23 | |
| 淋巴脉管间隙浸润 | ＜0.001 | ||
| 阴性 | 90 | 13 | |
| 阳性 | 11 | 16 |
宫颈癌淋巴结MM与患者预后的关系已越来越受到重视。Cibula等[10]在645例宫颈癌患者中发现SLN MM率为10.1%，且MM使患者总生存率降低，MM患者生存率与MC患者相当。Kocian等[11]的研究发现，与淋巴结阴性患者相比，MM患者的复发风险为4.62（95% CI 1.65~12.95），MC患者的复发风险为3.61（95% CI 1.03~12.69）。SLN中存在MM灶时，建议进行系统淋巴结清扫，并进行辅助治疗。
但是，术中常采用的FS与TIC有较高的假阴性率，主要原因为病灶偏倚，以及检测MM及ITC困难。为了提高对SLN中MM检测的灵敏度，对于超分期H-E染色阴性的SLN，术后必须进行IHC[12]。与术中FS相比，术后连续切片（0.04~0.25 mm间隔）联合IHC在检测MM时更可靠[13-14]，但此方法操作较繁琐、耗时、费用昂贵，目前尚未应用于术中检查[11-12]。OSNA方法的原理是采用逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）技术对细胞CK19 mRNA进行快速特定扩增，检测其拷贝数，由此判定淋巴结转移状态。OSNA既能满足术中快速进行SLN病理诊断的要求，又能弥补常规术中FS及TIC对MM检测假阴性率较高的不足。
一项多中心前瞻性研究[15]显示，OSNA检出乳腺癌患者SLN转移的特异度（94.3%）、与术后病理检测结果的一致性（93.1%）及阴性预测值（97.2%）均较高。Horn等[16]通过评估32例患者的130枚SLN，发现OSNA法与术后病理检测结果的相关性高达96%。Bizzarri等[17]证明，术中OSNA能检测早期宫颈癌SLN的小体积转移。另有文献[18]显示，116例宫颈癌患者中，SLN的MM率在OSNA组为11.6%，在IHC组为2.9%。本研究中，OSNA检测SLN MM与术后IHC检测一致性较高（Kappa值＝0.885），且检出灵敏度高于术中FS；术后H-E染色阴性经IHC发现的3例MM、2例ITC的CK19 mRNA拷贝数与其IHC结果一致。
本研究进一步发现，OSNA检出的阳性SLN大于1枚时，nSLN阳性比例升高，表明OSNA结果能较好反映盆腔淋巴结转移情况；同时，本研究显示，OSNA检测阳性的SLN的肿瘤分化分期更高、增殖指标Ki67表达更高、LVSI率更高。本研究表明术中OSNA对宫颈癌SLN MM患者预后有一定预测能力。
OSNA技术最大的优点为可一次性分析整个淋巴结组织，而H-E染色仅能分析约5%的组织。OSNA可以对乳腺癌SLN肿瘤总负荷（total tumor load, TTL）通过CK19 mRNA拷贝数进行精确定量，从而指导乳腺癌患者预后评估及辅助治疗方法的选择[19-21]。但是对于宫颈癌，OSNA的应用较少，寻找早期宫颈癌SLN TTL影响预后的OSNA检测截断值有重要意义。另有研究[22-26]发现，OSNA对新辅助化疗后乳腺癌SLN转移评估效果更好，因此OSNA可能有应用于新辅助化疗后局部晚期宫颈癌SLN转移评估的潜在价值。OSNA的局限性是不能用于SLN组织形态学分析，在低分化或去分化癌中可显示为阴性或检测值很小。此外，OSNA检测费用较高，较FS及IHC高10倍。
综上所述，本研究表明，OSNA对早期宫颈癌患者SLN的MM检出灵敏度、特异度较高，与金标准一致性较高，且灵敏度高于术中FS检测，对预后有一定的预测作用。本研究存在不足：纳入病例数较少，且SLN阳性患者较少，结果可能存在偏倚。未来增加病例，在验证本研究结论的基础上，结合更多临床参数建立预测模型，并引入OSNA测得TTL，以更准确为宫颈癌淋巴结转移状态提供定量参考，进而指导患者辅助治疗。
利益冲突： 所有作者声明不存在利益冲突。
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