微流控是使用微加工技术制造出的微管道（直径数十至数百微米）操纵和控制微小流体（μL至pL）的系统。微流控技术诞生于20世纪80年代，是一门涉及化学、流体物理、生物医学工程等领域的新兴交叉学科。微流控芯片可模拟体内的生理生化环境，以微通道网络贯穿细胞培养、分离等各个实验环节，具有集成度高、操作简单、样品消耗量小、减小人为干扰等优势，被称为芯片实验室（lab on a chip, LOC）。

精子优化是体外受精（in vitro fertilization, IVF）的关键步骤。经典的密度梯度离心和上游法筛选精子仅基于精子的活动能力，离心过程以及培养介质抗氧化能力的下降可能使精子活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加，并损伤精子DNA^[1-2]。精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index, DFI）升高会导致受精率降低、胚胎发育受损和妊娠率降低^[2]。为了解决传统精子优选方法的局限性，微流控芯片技术利用精子在女性体内的选择机制，无需离心即可将精液的原始样品有效地进行筛选（表 1）。研究^[3-4]显示，微流控芯片优选精子可显著减少ROS和DNA碎片；使用微流控装置可以从精液中分离出约40%的高活动精子亚群^[5]。可见，微流控芯片技术可以提高精子处理质量，或许能使精子处理方式获得重大进步。本文概述了微流控芯片技术在精子优选中的研究和应用进展。

1 微流控芯片用于精子优选的机制

精子在女性生殖道内需要经过多层优选，涉及多种生理生化机制。微流控芯片技术提供了更符合生理状态的精子分选过程。

1.1 基于负电荷的微流控分选

精子表面覆盖着一层糖萼，含有丰富的唾液酸，使精子胞膜负电荷化。精子在女性生殖道移行时，其表面的负电荷利用同性电荷相斥原理可有效地防止精子相互凝集成团块，使精子能够顺利地在管道内游动。2005年，Ainsworth等^[6]利用这一特性通过电泳分离技术，从人体精液中分离出高活动率、低DNA损伤和形态正常的精子。2007年，该团队首次将通过电泳分离技术分离的精子应用于临床，并成功获得妊娠^[7]。2012年，王雪梅等^[8]也成功制备了基于精子大小和表面电荷的电泳微流精子分离仪，可快速获得细胞膜成熟的精子。但目前基于负电荷的微流控芯片分选精子的报道较少，这一领域的空白有待填补。

1.2 基于趋流性的微流控分选

精子在女性生殖道内具有定向对抗流体自由游动的能力，即趋流性。2003年，Schuster等^[9]利用这一特性设计了一款微流控装置，用于筛选活力精子，筛选过程简单、快速，但由于制作工艺和微流体流速等限制，精子的回收率并不高。2014年，Nosrati等^[10]设计了一种由500个平行微通道组成的微流控装置，20 min内即可完成1 mL精液的分选，分选所得公牛精子活力提高了89%以上，人类精子DNA完整性提高了80%以上，工作效率得到了大幅提升。2015年，Kishi等^[11]进一步证明此种方法分选的精子具高活力和低DFI率。2016年，Shirota等^[3]使用微流控精子分选仪对健康志愿者的精液进行筛选，首次报道经过分选的精子DFI率可低至1%。随后，Nagata等^[12]和Quinn等^[13]对微流控装置进行了改进和优化，分选精子的质量进一步提高。2021年，Simchi等^[14]模拟女性生殖道和输卵管的复杂结构，开发了由6 500多条通道组成的多维微结构的3D装置，经过临床样本测试，分选的精子DNA完整性提高至95%，同时可缩短精子制备时间，提高了IVF效率。虽然传统密度梯度离心和上游法也是利用精子活力筛选，但是微流控芯片分选方式与体内过程更加接近，而且显著降低了精子遗传物质的损伤。此外，新开发的一种简单的微流体装置，可以去除精液中的病毒，分选100%健康的精子，成为辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）的理想选择^[15]。

1.3 基于趋化性的微流控分选

精子受卵细胞与其周围卵丘细胞分泌的化学物质诱导，感知这一浓度梯度，发生定向运动最终到达受精部位，即趋化学性。其中孕酮（P4）是主要的化学引诱剂。2006年，Koyama等^[16]首次采用微流控芯片观察了小鼠精子在卵巢提取物中的趋化性，发现小鼠具有化学趋向性的精子约占精子总数的7%，而人类精子占2%~12%。早在1993年，Kricka^[17]利用充满透明质酸（hyaluronic acid, HA）或宫颈黏液的微隔室，在微通道中实现了化学引诱剂驱动的精子分选。2013年，Chang等^[18]开发了一种基于水凝胶的微流控趋化性芯片。同年，Gatica等^[19]开发了基于精子趋化性进行分选的微流控装置，即用2 mm的管子连接两个直径2.5 mm的孔，一个孔中充满了含有趋化因子分子介质的溶液，另一个孔中充满了精子悬浮液。趋化剂通过连接管扩散，产生梯度，而精子则向较高浓度方向迁移，该装置分选精子效率较常规精子处理方法提高了3倍，降低了精子ROS和DFI水平。2021年，课题组使用HA作为宫颈黏液的替代品模拟宫颈微环境，设计的宫颈芯片用于临床不孕不育诊断^[20]。

1.4 基于趋温性的微流控分选

精子易受高温环境的诱导，女性排卵时，输卵管峡部与壶腹部产生2℃的温度差，具有趋温性的精子会感知这一温度梯度并主动游向壶腹部，即趋温性。2003年，Bahat等^[21]首次通过微流控证实兔精子趋温性的存在，兔精子中有趋温性者占比为7%~17%，而人类精子约3%~5%。2018年，Pérez-Cerezales等^[22]利用精子趋温这一特性开发了微流控分选方法，即由毛细管连接2个液滴，其中一滴放精子，另一滴保持高温，2个液滴之间产生温度梯度，精子趋向在温暖的液滴中积聚。研究证实，通过趋温性选择的小鼠精子具有更高的DNA完整性，卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）后可显著提高受精率、优质胚胎率和囊胚形成率，妊娠率提高了一倍，证明了该技术的安全性^[22]。同年，Ko等^[23]建立了一种同时结合趋温性和趋化性特点进行精子分选的微流控综合装置。目前，基于趋温性的微流控精子分选技术简单方便。

2 微流控芯片分选的精子在IVF中的应用 2.1 微流控芯片技术对胚胎质量和妊娠率的影响

精子优化的目的是获得形态正常、活力高、DFI低的高质量精子。微流控技术优选精子已被证明可减少ROS和降低DFI，但其对胚胎质量和妊娠率的影响是研究人员和临床医生更加关注的问题。近期一项前瞻性随机对照研究^[24]证实，使用微流控Fertile Chip®选择的精子行ICSI，可提高不明原因不孕症患者的优质胚胎率。2019年，Gode等^[25]利用微流控芯片优选精子用于宫内人工授精（intrauterine insemination, IUI），显著提高了持续妊娠率。2020年，Ozcan等^[26]首次评估微流控芯片分选精子对男性不育症（180例）患者IVF的结局影响，结果显示，微流控芯片分选组的临床妊娠率和持续妊娠率有增高的趋势，但受到样本量和回顾性研究设计的限制，组间差异没有统计学意义。2021年，Anbari等^[27]报道，微流控芯片分选可提高ICSI周期胚胎质量、种植和妊娠率。一项前瞻性研究^[28]结果显示，微流控芯片分选精子可显著提高弱畸精症患者的优质囊胚率。该研究为微流控芯片方法在弱精症患者中的应用奠定了基础。另一回顾性研究^[29]评估了微流控芯片分选和密度梯度离心法对反复着床失败和精子高DFI夫妇的胚胎质量和整倍体率的影响，结果显示：两种方法受精率、整倍体率、流产率和活产率方面差异无统计学意义，但微流控组囊胚数和优质囊胚数显著增加。该研究侧重于高DFI人群，可能受胚胎基因组混杂因素的影响。Godiwala等^[30]在预后良好的患者中也证实了微流控可显著提高囊胚率、优质囊胚率、整倍体率。与前两项研究结果不同的是，受精率也显著提高。然而，也有研究报道微流控芯片分选精子与密度梯度法组在胚胎卵裂率、囊胚率、妊娠率方面差异无统计学意义^[31]，但是微流控技术简化工作流程、减少人为干预，在提高IVF实验室的自动化等方面有更大的应用前景。最近，Godiwala等^[32]发起了一项设计严谨的双盲前瞻性随机临床试验，研究深入探讨精子对整倍体的贡献，将为微流控精子分选改善胚胎结果提供有力证据。目前，微流控芯片工艺复杂，现有技术平台仍然缺乏临床适用性。Xiao等^[33]设计了用于ICSI的微流体精子选择盘，更加适应临床工作流程，改善临床结局。

2.2 体外受精集成化微流控芯片的技术实现过程

IVF是ART中的重要环节，如何将精子优选和精卵结合以及早胚发育体系集成在同一微流控芯片上，实现标准化体外受精过程是微流控芯片技术研究的方向和面临的挑战。1995年，美国宾夕法尼亚大学Kricka等^[34]最先尝试制作了小鼠IVF芯片，在一个狭小的空间里精子直接游向卵细胞并完成受精，受到精子的进样量少等因素的影响, 受精率比常规IVF低17 %~32 %（48%~58% vs 65%~80%），但该芯片首次实现了微环境下小鼠IVF，为辅助生殖领域揭开了新的篇章。2005年，Clark等^[35]制作的PDMS-玻璃芯片是一种由重力驱动液体流动的装置，管道上凸起一个20 μm高的“瓶颈”结构，将猪卵定位，从另一侧加入的精子与其相遇完成体外受精，该体系中的受精率、卵裂率和囊胚形成率与传统微滴法差异虽无统计学意义，但是可显著减少多精入卵的发生。2006年，Suh等^[36]制作的微流控管道设计了“关卡”结构用来定位小鼠卵细胞，从另一侧管道引入精子并完成受精和胚胎培养。用比传统IVF精子需要量[（0.5~1.0）×10⁶个/mL]更少的精子[（2~8）×10⁴个/mL]实现了微流控技术的IVF，证明了微流控技术在体外受精研究中的优越性。2010年，Han等^[37]在微通道内设计了凹槽结构来定位卵细胞，精子流入通道内完成“一站式”受精，换液和胚胎培养，简化了IVF的操作流程，而且芯片组与传统微滴培养组胚胎发育无明显差别。2011年，Ma等^[38]开发的新型微流控设备，将卵细胞定位在芯片中央并与4个对称通道交叉，集成了精子筛选、卵母细胞定位、受精、培养基更换和胚胎培养等步骤，与常规培养皿组胚胎发育和囊胚形成率无显著差异。此装置的亮点在于其开放式的培养结构可方便地取回胚胎用于下一步冷冻或者移植。2014年，王维等^[39]证明基于微流控芯片的胚胎动态培养方法可以显著改善小鼠胚胎质量。2015年，Huang等^[40]设计微流控体外受精芯片用于小鼠IVF，受精率较常规IVF提高5%，囊胚率提高20%。2019年，袁学锋等^[41]发明一种辅助IVF的微流控生殖芯片。2020年，汪萌等^[42]构建基于微流控芯片来模拟体内受精及早期胚胎发育环境的仿真输卵管模型，为进一步改善ART和提高受精率和优胚率奠定基础。尽管动物实验已经证明了微流控芯片的巨大潜力，但是目前这种IVF胚胎培养的整合性微流控芯片仍在研究阶段，受精率较低，完全集成的系统有待于建立。

3 小结

在过去的20年中，微流控芯片技术在精子优选中已经迈出重要一步。微流控芯片技术使得通常在宏观上不可能实现的技术成为可能，不仅可以增进医学界对人类精子迁移的理解、获得高质量的精子用于辅助生殖，而且可以简化传统分选方法中繁琐的操作过程，提高IVF的标准化水平。鉴于目前研究的局限性，未来需要设计更加缜密的前瞻性随机对照研究对微流控芯片分选精子的临床效果和安全性进行评价。将精子筛选和精卵结合以及早胚发育体系整合的多模块微流控系统是未来生殖医学发展的方向。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。