2023, Vol. 30
由于生活方式、饮食习惯的改变，糖尿病的发病率逐年上升，已成为全球范围内威胁人类生命健康的主要因素之一[1]。血糖的异常升高往往导致全身一系列脏器出现继发性的病理改变，其中高血糖引起的血管结构和功能改变是最普遍和重要的。血管内皮细胞在维持血管的正常结构与功能中发挥着主要作用，而高血糖往往诱发血管内皮细胞的功能紊乱，因此血管内皮细胞的功能障碍被认为是糖尿病各种并发症的主要病理生理机制之一[2]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一[3-4]，严重影响糖尿病患者的生存和预后。然而，目前关于高糖环境对于血管内皮细胞功能结构的影响尚未完全阐明。
环状RNA(circular RNA, circRNA)属于非编码RNA(ncRNAs)的一种，主要以竞争性内源RNA（ceRNA）方式与miRNA结合，从而对下游靶基因进行调控[5]。近年来，circRNA在糖尿病发生发展中的作用被广泛研究。Liu等[6]研究发现，circ_0080425可促进糖尿病中肾小球系膜细胞的增殖和纤维化，提示circ_0080425的异常表达在糖尿病的发生发展中扮演着重要角色，但是circ_0080425对于高糖环境下血管内皮结构与功能的影响还未完全阐明。因此，本研究旨在探讨circ_0080425在高糖环境下调控血管内皮功能的作用及其分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂人血管内皮细胞(human vascular endothelial cells，HUVECs)购自ATCC，所有细胞均于37℃、5% CO2培养箱中培养。TRIzol试剂购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq GC试剂盒购自Takara公司；Lipofectamine 2000试剂购自Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；CCK-8试剂购自TargetMol公司。
1.2 Circ_0080425的干扰与过表达HUVECs计数后接种于6孔板，过夜培养后，加入Lipo 2000和siRNA（si-NC或si-circ_0080425）进行siRNA转染。
HUVECs计数后接种于6孔板，circ_0080425过表达质粒转染HUVECs，24 h后获得circ_0080425过表达细胞系。
1.3 CCK-8实验细胞计数后铺板96孔板，以细胞贴壁时间点为0 h，在相应时间点加入10 μL CCK-8溶液90 μL无血清培养基；将培养板在培养箱内孵育1 h；用酶标仪测定在450 nm的吸光度，并计算各组细胞的细胞活性。
1.4 平板克隆实验细胞计数后，取3 000/孔细胞种于12孔板中，7 d后4%多聚甲醛固定4 h，然后将小室放入1%结晶紫溶液中染色5 min，PBS清洗后进行拍照，随机选取5个视野进行计数统计。
1.5 流式检测细胞凋亡细胞接种在6孔板中过夜培养，收集上清中悬浮的凋亡细胞和贴壁细胞，用预冷缓冲液清洗细胞沉淀，并用100 μL结合缓冲液重悬细胞沉淀。加入5 μL APC Annexin Ⅴ和5 μL的7-AAD染色液在4℃避光孵育15 min，孵育结束后于流式细胞仪中检测。
1.6 Transwell实验下室提前加入20% FBS的培养基1 mL，无血清培养基重悬计数细胞（5×105个/mL）后，向上室加入200 μL，孵箱中培养48 h后将小室置于4%多聚甲醛中固定4 h，然后在1%结晶紫中染色5 min，PBS清洗后在显微镜下拍照计数。
1.7 RNA提取及qRT-PCRTRIzol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度后逆转录成cDNA, 通过SYBR® Premix Ex TaqTM GC试剂盒进行qRT-PCR。
1.8 Western印迹实验细胞裂解后离心提取细胞总蛋白，BCA测量蛋白浓度，每个样品上样30 μg进行电泳，转印至PVDF膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗涤后二抗常温孵育2 h，ECL化学凝胶成像仪中进行显影。PTX3抗体、VEGF抗体、VEGFR抗体、FGF9抗体、GAPDH抗体购自Abcam公司。
1.9 双荧光素酶报告实验根据结合位点序列设计引物，将circ_0080425野生型（含有miR-1182结合位点）或突变型（miR-1182结合位点突变）序列插入报告基载体构建双荧光素酶报告基因质粒；同样方法构建FGF9 3’-UTR野生型（含有miR-1182结合位点）和突变型（miR-1182结合位点突变）双荧光素酶报告基因质粒。各组细胞转染报告基因质粒48 h后，参照试剂盒操作说明检测荧光素酶活性。
1.10 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，采用Student’s t检验，不符合的以M(P25, P75)表示，采用Mann-Whitney U检验。计数资料以n(%)表示。每组实验均重复3次。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 干扰circ_0080425抑制高糖条件下HUVECs生长、迁移并诱导凋亡用不同浓度D-葡萄糖处理HUVECs，模拟体内高糖环境，RT-qPCR检测结果(图 1A)发现，circ_0080425在高糖培养条件下表达上调。为探索circ_0080425在糖尿病中的作用，利用siNRA转染HUVECs，构建circ_0080425的干扰细胞系(图 1B)。在干扰circ_0080425后，CCK-8实验、克隆形成实验和Transwell实验结果(图 1C~E)显示，高糖条件下HUVECs的增殖和迁移能力被明显抑制，流式细胞检测提示细胞的凋亡比例明显升高(图 1F)。此外，Western印迹法检测结果(图 1G)发现，干扰circ_0080425后，HUVECs中血管形成相关蛋白PTX3、VEGF和VEGFR被下调。这些结果提示，干扰circ_0080425可以抑制高糖条件下HUVECs生长、迁移并诱导细胞凋亡。
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| 图 1 干扰circ_0080425抑制高糖条件下HUVECs生长、迁移和诱导凋亡 A：RT-qPCR检测不同浓度D-葡萄糖处理过的HUVECs中circ_0080425的表达；B：RT-qPCR检测circ_0080425干扰细胞及对照细胞中circ_0080425的水平；C：CCK-8实验检测circ_0080425干扰细胞及对照细胞的细胞活性，以细胞汇合度达到50%时作为0 h，检测0 h、24 h、48 h、72 h的细胞活性；D：平板克隆实验检测circ_0080425干扰细胞及对照细胞的克隆形成情况；E：Transwell实验检测circ_0080425干扰细胞及对照细胞的迁移情况；F：流式细胞术检测circ_0080425干扰细胞及对照细胞的凋亡情况；G：Western blot检测circ_0080425干扰HUVECs及对照细胞中PTX3、VEGF和VEGFR的蛋白表达。*P＜0.05。 |
生物信息学网站Circinteractom(图 2A)预测，miR-1182与circ_0080425有靶向关系。通过RT-qPCR(图 2B)发现，在HUVECs中干扰circ_0080425可上调miR-1182的表达，而在HUVECs中过表达circ_0080425可下调miR-1182的表达(图 2C)。用不同浓度D-葡萄糖处理HUVECs，模拟体内高糖环境，RT-qPCR检测(图 2D)发现，miR-1182在高糖培养条件下表达也下调。利用双荧光素酶报告系统鉴定二者关系结果(图 2E)显示，共转染circ_0080425-WT和miR-1182的处理组中荧光素酶活性显著下降，而转染circ_0080425-Mut和miR-1182的处理组中荧光素酶活性没有受影响，提示circ_0080425与miR-1182二者有结合关系。综合上述结果，miR-1182与circ_0080425有靶向关系，且circ_0080425负调控miR-1182的表达。
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| 图 2 Circ_0080425负向调控miR-1182的表达 A：Circinteractome预测miR-1182与circ_0080425的可能结合位点；B：qRT-PCR检测circ_0080425干扰HUVECs和对照细胞中miR-1182的表达；C：qRT-PCR检测circ_0080425过表达HUVECs和对照细胞中miR-1182的表达；D：RT-qPCR检测不同浓度D-葡萄糖处理的HUVECs中miR-1182的表达；E：在转染野生型或突变型circ_0080425质粒的miR-1182过表达HUVECs和对照细胞中进行荧光素酶报告基因测定。 |
生物信息学网站TargetScanHuman 8.0(图 3A)预测，FGF9是miR-1182的靶点。RT-qPCR和western blot检测(图 3B、3C)显示，细胞中过表达或敲减miR-1182能负调控FGF9的表达。此外，细胞中过表达或敲减circ_0080425也可上调或下调FGF9的表达(图 3D、3E)。利用不同浓度D-葡萄糖处理HUVECs，模拟体内高糖环境，RT-qPCR和western印迹法检测(图 3F、3G)发现FGF9在高糖培养条件下表达上调。双荧光素酶报告系统验证两者的结合关系结果(图 3H)显示，共转染miR-1182与FGF9-WT的处理组荧光素酶活性下降，而转染FGF9-Mut和miR-1182的处理组中荧光素酶活性无差异。上述结果表明FGF9是miR-1182的靶基因之一，且miR-1182负调控FGF9的表达。
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| 图 3 miR-1182负向调控FGF9的表达 A：TargetScanHuman 8.0预测miR-1182与FGF9的潜在结合位点；B：qRT-PCR检测miR-1182干扰/过表达HUVECs和对照细胞中FGF9的mRNA表达；C：Western印迹法检测miR-1182干扰/过表达HUVECs和对照细胞中FGF9的蛋白表达；D：qRT-PCR检测circ_0080425干扰/过表达HUVECs和对照细胞中FGF9的mRNA表达；E：Western印迹法检测circ_0080425干扰/过表达HUVECs和对照细胞中FGF9的蛋白表达；F：RT-qPCR检测不同浓度D-葡萄糖处理过的HUVECs中FGF9的mRNA表达；G：Western印迹法检测不同浓度D-葡萄糖处理过的HUVECs中FGF9的蛋白表达；H：在转染野生型或突变型FGF9 3'-UTR质粒的miR-1182过表达HUVECs和对照细胞中进行荧光素酶报告基因测定。*P＜0.05。 |
CCK-8、克隆形成和Transwell实验结果(图 4A~4C)发现，在circ_0080425干扰细胞中过表达miR-1182 sponge或FGF9，可逆转干扰circ_0080425对高糖条件下细胞增殖和迁移能力的抑制。流式细胞术检测(图 4D)发现，在circ_0080425干扰细胞中过表达miR-1182 sponge或FGF9，可逆转干扰circ_0080425对高糖条件下细胞凋亡的诱导。这些结果提示，circ_0080425通过miR-1182/FGF9调控高糖环境下HUVECs生长、迁移和凋亡。
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| 图 4 Circ_0080425通过miR-1182/FGF9调控HUVECs生长、迁移和凋亡 A：Circ_0080425干扰细胞中感染miR-1182 sponge或FGF9，48 h后CCK-8实验检测细胞活性；B：Circ_0080425干扰细胞中感染miR-1182 sponge或FGF9，平板克隆实验检测细胞的克隆形成情况；C：Circ_0080425干扰细胞中感染miR-1182 sponge或FGF9，Transwell实验检测细胞的迁移情况；D：Circ_0080425干扰细胞中感染miR-1182 sponge或FGF9，流式细胞术检测细胞凋亡比例。*P＜0.05。 |
近年来，大量研究认为circRNA在信号分子转录后水平上起着重要的调控作用，其异常表达与多种疾病相关。在糖尿病中，circRNA也发挥着重要作用。以往研究[7]发现，circRNA15698-miR-185-TGF-β1这一通路能够影响肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的沉积，从而影响糖尿病肾病的进展，该研究为探索ncRNAs与糖尿病肾病之间的关系提供了新的思路。本研究发现circ_0080425的表达可被高糖激活，在高糖培养下的HUVECs中表达上升。本研究体外实验表明，circ_0080425可以促进血管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡，其在高糖环境下的异常表达可能是影响血管内皮细胞功能的因素之一。
目前认为circRNA主要作为miRNA海绵来减弱其活性。生物信息学提示miR-1182可能和circ_0080425直接结合，并被荧光素酶实验证实。已有研究[8-10]发现，miR-1182参与了肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡，但在糖尿病进展中的作用并未见报道。本研究发现miR-1182在高糖处理后的HUVECs中显著下调，这与circ_0080425的表达趋势相反。进一步分析发现，miR-1182和circ_0080425在调节HUVECs增殖、迁移和凋亡方面具有拮抗作用，且两者相互抵消。
生物信息学分析提示，FGF9是miR-1182的下游靶点，并通过荧光素酶实验进行了验证。FGF9是成纤维细胞生长因子家族的一员，其在多种组织器官中表达并发挥多种生理功能，如有丝分裂、器官发育和修复等[11]。也有研究[12]报道FGF9可能参与糖尿病的进展，但具体功能和机制并不清楚。本研究发现在高糖环境下的HUVECs中FGF9的表达被明显上调。此外，本研究发现FGF9的表达与circ_0080425和miR-1182的表达情况相关。CCK-8检测、平板克隆、transwell和流式细胞凋亡检测等实验也进一步验证，circ_0080425通过与miR-1182的结合释放了被miR-1182抑制的FGF9，导致血管内皮细胞增殖、迁移能力的增强和凋亡的减少。
综上所述，本研究发现了一个新的circ_0080425-miR-1182-FGF9信号轴，circ_0080425通过靶向miR-1182/FGF9促进血管内皮细胞增殖、迁移和抑制凋亡。该通路的作用在动物模型中还需要进一步验证，但本研究为探索高糖环境下血管内皮功能障碍的相关机制提供了新的线索。
利益冲突： 所有作者声明不存在利益冲突。
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