2023, Vol. 30
糖尿病肾病属于糖尿病的一种微血管并发症，代谢异常与炎症反应都会引起糖尿病肾病，如果没有及时诊疗，严重者会发生肾脏功能衰竭导致死亡。目前，临床多通过控制血糖延缓糖尿病肾病进程，缺乏有效的治疗方法[1]。达格列净（dapagliflozin）是新型口服降糖药，不仅能够降低血糖，还能保护肾脏疾病患者肾功能。近期研究[2-3]表明，达格列净能通过抑制足细胞损伤延缓糖尿病肾病发展。
p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是MAPKs家族重要成员，影响细胞分化、凋亡与炎症反应，且影响糖尿病肾病进程[4]。Shahrani等[5]发现，决明子叶提取物能通过p38 MAPK信号通路减弱大鼠肾小球内皮细胞自噬作用，改善其糖尿病肾病。目前，达格列净能否通过p38 MAPK信号通路影响足细胞生物学行为，进而干预糖尿病肾病进程，尚不明确。
本研究采用D-葡萄糖诱导人肾小球足细胞（human glomerular podocytes，HGPCs）高糖模型，探讨达格列净对高糖诱导的HGPCs凋亡、自噬及炎症反应的影响及与p38 MAPK信号通路的关系，以期为达格列净肾脏保护机制的深入研究提供体外依据。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂HGPCs购自北京北纳创联生物技术研究院。达格列净购自湖北威德利化学科技有限公司，D-葡萄糖购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，p38 MAPK通路抑制剂SB 203580、p38 MAPK通路激活剂C16-PAF购自上海源叶生物科技有限公司，DMEM-F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，青-链霉素混合液购自北京诺博莱德科技有限公司。CCK-8试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，ELISA检测试剂盒购自上海和序生物科技有限公司，RNA抽提试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司（引物购自北京擎科生物科技股份有限公司）。鼠抗人[酵母ATG6同源物（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）Ⅱ、p53、p38 MAPK、p-p38 MAPK及β-actin一抗]、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）购自武汉三鹰生物技术有限公司。7500型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。本研究经来宾市人民医院医学伦理委员会批准（2022-19）。
1.2 HGPCs培养及达格列净浓度选择冻存HGPCs进行复苏后，加入DMEM-F12培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素），置于37℃、5% CO2条件培养箱中培养，细胞密度为80%~90%时进行细胞传代或后续实验。
将HGPCs分为对照组、D-葡萄糖组、达格列净（低、中、高）组进行预实验：对照组加入5 mmol/L D-葡萄糖处理24 h；D-葡萄糖组加入30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h；达格列净低/中/高组在D-葡萄糖诱导24 h后，分别加入12.5、25、50 μmol/L达格列净进行24 h干预。根据CCK-8预实验结果选择50 μmol/L达格列净（图 1）进行后续实验。
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| 图 1 CCK-8法选择达格列净浓度 对照组加入5 mmol/L D-葡萄糖处理24 h；D-葡萄糖组加入30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h；达格列净低、中、高组加入5 mmol/LD-葡萄糖诱导24 h后，分别加入12.5、25、50 μmol/L达格列净，干预24 h。*P＜0.05与对照组相比；△P＜0.05与D-葡萄糖组相比。 |
将HGPCs分为对照组、D-葡萄糖组、达格列净组、抑制剂组、达格列净+抑制剂组和达格列净+激活剂组：对照组加入5 mmol/L D-葡萄糖干预24 h；D-葡萄糖组加入30 mmol/L D-葡萄糖干预24 h；达格列净组在D-葡萄糖诱导24 h后，加入50 μmol/L达格列净干预24 h；抑制剂组在D-葡萄糖诱导24 h后，加入10 μmol/L p38 MAPK通路抑制剂SB 203580干预24 h；达格列净+抑制剂组在D-葡萄糖诱导24 h后，加入50 μmol/L达格列净及10 μmol/L SB 203580干预24 h；达格列净+激活剂组在D-葡萄糖诱导24 h后，加入50 μmol/L达格列净及10 μmol/L p38 MAPK通路激活剂C16-PAF干预24 h。每组设置3个复孔。
1.4 CCK-8法测定HGPCs细胞活力收集对数期生长的细胞，调整密度至2×105个/mL，接种于96孔板，每孔加细胞悬液100 μL。各组细胞干预后，加入CCK-8溶液10 μL孵育2 h，用酶标仪测定各组光密度（D450）。
收集各组干预后细胞，用PBS洗涤2次，加入新鲜配置的4%多聚甲醛，4℃固定10 min，PBS洗涤3次；Hoechst 33258染色液（5 mg/L）染色10 min，PBS洗涤3次；封固后荧光显微镜观察、拍照。细胞凋亡特征为核体积缩小，染色不均浓染且发较强亮蓝色荧光。
1.6 ELISA测定炎症因子及过氧化指标水平收集各组干预24 h后的细胞，于4℃以12 000×g离心10 min，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书，测定细胞中白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醇（propylene glycol，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，以D450表示。
1.7 RT-qPCR测定HGPCs细胞自噬收集各组干预后的细胞，用RNA抽提试剂盒提取细胞样本总RNA，反转录为cDNA（引物序列见表 1），取2 μL反转录产物进行PCR检测，每个样品重复检测5次。以GAPDH基因作为内参，2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
| 名称 | 引物序列 |
| GAPDH | |
| F (5'-3') | TGACTTCAACAGCGACACCCA |
| R(5'-3') | CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA |
| Beclin-1 | |
| F (5'-3') | AACCAACGTCTTTAATGCAACCTTC |
| R(5'-3') | AGCAGCATTAATCTCATTCCATTCC |
| LC3Ⅱ | |
| F (5'-3') | AACATGAGCGAGTTGGTCAAG |
| R(5'-3') | GCTCGTAGATGTCCGCGAT |
收集各组干预后各组细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭2 h后参照抗体说明书，加入一定稀释比例的Beclin-1、LC3 Ⅱ、p53、p38 MAPK、p-p38 MAPK及β-actin一抗，4℃孵育过夜，次日洗膜TBST洗涤后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗涤3次，用显影液及凝胶成像系统显影并拍照记录。
1.9 统计学处理采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料均符合正态分布，以x±s表示，多组间采用单因素方差分析，两组间比较Dunnett t检验；检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 HGPCs细胞凋亡能力Hoechst 33258染色结果（图 2）显示：与对照组相比，D-葡萄糖组细胞凋亡率升高（P＜0.05）。与D-葡萄糖组相比，达格列净组、抑制剂组细胞凋亡率降低（P＜0.05）。与达格列净组相比，达格列净+抑制剂组细胞凋亡率进一步降低（P＜0.05），达格列净+激活剂组细胞凋亡率升高（P＜0.05）。
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| 图 2 各组HGPCs细胞凋亡率比较 A：Hoechst 33258染色；B：定量分析。HGPCs：人肾小球足细胞。Original magnification: ×20；n＝3, x±s；*P＜0.05与对照组相比，△P＜0.05与D-葡萄糖组相比，▽P＜0.05与达格列净组相比。 |
ELISA结果（图 3）显示：与对照组相比，D-葡萄糖组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）。与D-葡萄糖组比较，达格列净组、抑制剂组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。与达格列净组比较，达格列净+抑制剂组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平进一步降低（P＜0.05），达格列净+激活剂组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）。
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| 图 3 各组HGPC细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 HGPCs：人肾小球足细胞；IL-1β：白细胞介素1β；IL-6：白细胞介素6；TNF-α：肿瘤坏死因子α。n＝3, x±s；*P＜0.05与对照组相比，△P＜0.05与D-葡萄糖组相比，▽P＜0.05与达格列净组相比。 |
ELISA结果（图 4）显示：与对照组比较，D-葡萄糖组细胞MDA水平升高、SOD水平降低（P＜0.05）。与D-葡萄糖组比较，达格列净组和抑制剂组MDA水平降低、SOD水平升高（P＜0.05）。与达格列净组比较，达格列净+抑制剂组MDA水平进一步降低，SOD水平进一步升高，达格列净+激活剂组MDA水平升高、SOD水平降低（P＜0.05）。
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| 图 4 各组HGPCs MDA和SOD表达水平比较 HGPCs：人肾小球足细胞；MDA：丙二醇；SOD：超氧化物歧化酶。n＝3, x±s；*P＜0.05与对照组相比，△P＜0.05与D-葡萄糖组相比，▽P＜0.05与达格列净组相比。 |
结果（图 5）显示：与对照组相比，D-葡萄糖组细胞Beclin-1、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与D-葡萄糖组比较，达格列净组、抑制剂组细胞Beclin-1、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与达格列净组比较，达格列净+抑制剂组细胞Beclin-1、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白表达水平进一步降低（P＜0.05）；达格列净+激活剂组Beclin-1、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白表达水平进一步升高（P＜0.05）。
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| 图 5 各组HGPCs细胞自噬相关因子mRNA和蛋白表达比较 A：Western印迹检测蛋白表达；B：Western印迹定量结果；C：RT-qPCR检测mRNA相对表达量。Beclin-1：酵母ATG6同源物；LC3Ⅱ：微管相关蛋白1轻链3Ⅱ。n＝3, x±s；*P＜0.05与对照组相比，△P＜0.05与D-葡萄糖组相比，▽P＜0.05与达格列净组相比。 |
结果（图 6）显示：与对照组比较，D-葡萄糖组细胞p53、p-p38 MAPK蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与D-葡萄糖组比较，达格列净组和抑制剂组p53、p-p38 MAPK蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与达格列净组比较，达格列净+抑制剂组p53、p-p38 MAPK蛋白表达水平进一步降低（P＜0.05），达格列净+激活剂组p53、p-p38 MAPK蛋白表达水平升高（P＜0.05）。各组p38 MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义。
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| 图 6 各组HGPCs中p53、p38 MAPK信号通路相关蛋白表达水平比较 A：Western印迹检测蛋白表达；B：Western印迹定量结果。MAPK：丝裂原活化蛋白激酶。n＝3, x±s；*P＜0.05与对照组相比，△P＜0.05与D-葡萄糖组相比，▽P＜0.05与达格列净组相比。 |
足细胞在肾小球基底膜外表面排列，是肾小球滤过屏障的关键组成部分，与肾小球基底膜、内皮细胞共同参与调节肾小球滤过功能。糖尿病肾病患者由于足细胞凋亡增加，肾小球滤过屏障功能减弱，进而出现蛋白尿[6]。达格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，在降低血糖的同时具有肾脏保护作用。祝再然等[7]研究发现，达格列净能使糖尿病肾病大鼠血糖水平降低，并减轻足细胞损伤，减少尿蛋白，改善肾功能。本研究中，用50 μmol/L达格列净干预后，D-葡萄糖引起的HGPCs细胞活力降低改善明显，且细胞凋亡率降低（P＜0.05）。
炎症反应参与多种疾病的生理与病理进程，是机体较为重要的防御机制，Mihai等[8]研究显示，炎症反应可影响肾内微循环调节与灌注分布，导致IL-6、TNF-α等炎症因子在体内积累，加快慢性肾脏病进展。本研究中，D-葡萄糖组HGPCs IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高。孙凌云等[9]研究证实，达格列净能使高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2中氧化应激和肾损伤标志物MDA的水平降低、SOD水平升高。自噬是细胞内高度保守的物质分解代谢与循环过程，氧化应激所产生的活性氧能诱导自噬的发生，而自噬又能够下调活性氧水平，从而调节细胞氧化应激水平[10]。本研究发现达格列净和SB 203580能够降低D-葡萄糖诱导的HGPCs细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平，且自噬相关因子Beclin-1、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白表达水平也发生降低现象，而SOD水平升高，提示达格列净和SB 203580可以抑制足细胞凋亡、自噬与炎症反应，保护细胞氧化损伤。
MAPK是包括p38 MAPK、应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase, SAPK）及细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）等在内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族。p38 MAPK作为该家族重要成员，参与调节细胞分化、凋亡及炎症反应等多种生物学过程[11-13]。Lu等[14]研究发现，蛋白磷酸酶2A能通过抑制p38 MAPK通路改善足细胞损伤。Zhu等[15]报道，p38 MAPK信号通路与糖尿病肾病进程关系密切。马冰沁等[16]研究证实，芦荟苷能通过下调p38 MAPK信号通路实现抗炎和改善足细胞损伤作用；同时，该研究中，芦荟苷干预后大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平与肾组织中MDA、活性氧（reactive oxygen species, ROS）降低，肾组织中SOD水平升高。Fırat等[17]研究表明，达格列净能够发挥对糖尿病肾病大鼠的保护作用。杨晶[18]关于达格列净通过p38 MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞生长的结论也提示两者存在一定关系。本研究中，D-葡萄糖组HGPCs中p53、p-p38 MAPK蛋白表达升高（P＜0.05），达格列净组细胞中p53、p-p38 MAPK蛋白表达降低（P＜0.05），同时达格列净抑制了高糖引起的细胞凋亡率、炎症反应、自噬、氧化应激水平的升高（P＜0.05），与p38 MAPK抑制剂组表现一致，提示达格列净可能通过下调p38 MAPK信号通路活性水平发挥对足细胞的保护作用。
综上所述，本实验显示，达格列净能抑制D-葡萄糖诱导的HGPCs凋亡、炎症反应、自噬与氧化损伤，与p38 MAPK通路抑制剂保护HGPCs的作用一致，提示达格列净可能通过抑制p38 MAPK通路发挥对肾脏功能的保护功能。但达格列净是否还存在其他途径调控D-葡萄糖诱导的HGPCs的生物学行为，仍须进一步验证。
利益冲突： 所有作者声明不存在利益冲突。
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