2023, Vol. 30
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）是一种慢性进行性自身免疫性疾病，多发生于儿童及青少年，发病率逐年升高[1]。近年来T1DM免疫治疗越来越受到关注，作用于B细胞的CD20单抗、作用于T细胞的CD3单抗以及谷氨酸脱羧酶（GAD）疫苗等逐渐应用于T1DM患者[2-4]，但这些药物或疫苗延缓患者胰岛功能下降的效果不佳。
调节性T细胞（Treg）与T1DM发生发展相关[5]。多项研究[6-8]通过小剂量白介素-2（IL-2）刺激Treg细胞或直接输注功能正常的Treg细胞来治疗T1DM，但结果并不理想。Treg细胞可分为静息状态的Treg细胞(rTreg)以及活化状态的效应Treg细胞（eTreg），由于其激活程度、功能性和组成缺乏同质性[9]，需要细化其在T1DM发生发展中起关键作用的亚群，以实现更精准的免疫治疗。
近期研究表明，刺激抗原受体（T细胞和B细胞受体）、细胞因子受体等能激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），主要受磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的调控，而PI3K/mTOR信号通路与Treg细胞生长、增殖密切相关[10]，抑制mTOR可使CD4+CD25+Treg细胞增加[11]。PI3K相关信号通路受磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的负反馈调节[12]，而miRNA-24能抑制PTEN表达[13]，且有动物研究[14]发现其能抑制胰岛β细胞增殖。
因此，本研究探讨T1DM患者调节性Treg亚群比例，血清miRNA-24、mTOR水平，并分析miRNA-24、mTOR与调节性Treg亚群比例的相关性，旨在为T1DM免疫治疗提供参考。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2020年1月至2022年1月在南通大学附属常熟医院内分泌科就诊的40例T1DM患者为T1DM组，其中男性18例、女性22例，年龄15~53岁，平均年龄（31.75±8.68）岁；病程为3个月~15年，平均病程（6.38±3.78）年。T1DM诊断符合1999年WHO标准。纳入标准：（1）起病后长期依赖胰岛素治疗，且初次治疗时C肽低于1.1 ng/mL；（2）糖尿病4项抗体，包括GAD抗体（GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2A）、锌转运体8自身抗体（ZnT8A）、胰岛细胞自身抗体（ICA）中至少1项为阳性。排除标准：（1）6个月内接受任何影响RNA合成和转录的药物；（2）急性感染；（3）合并肿瘤及其他免疫疾病。T1DM患者中，GADA阳性26例（44.83%）、IA-2A阳性4例（6.90%）、ZnT8A阳性12例（20.69%）、CA阳性16例（27.59%）。选择同期在本院进行健康体检者40例作为对照组，其中男性21例、女性19例，年龄18~65岁，平均年龄（32.03±10.01）岁。本研究经常熟市第二人民医院伦理委员会批准（2020-KY-014），受试者均签署知情同意书。
1.2 流式细胞术检测Treg细胞及亚群所有受试者均为空腹8 h状态下于清晨采用真空促凝管抽取肘静脉血10 mL（2份），一份2 h内以2 500 r/min（r＝10 cm）离心20 min分离血清，放入﹣80℃冰箱冻存；另一份在4 h内行流式细胞术检测。
通过Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC），分别用抗人CD4抗体（FITC，BD公司）、抗人CD8抗体（PerCP-Cy5.5，Abcam公司）、抗人CD25抗体（APC，BD公司）、抗人CD45RA抗体（Alexa Flour 700TM，BD公司）、抗人CD127抗体（PE，Abcam公司）于室温避光进行细胞表面标记30 min；PBS清洗2次，用Fix/Perm缓冲液室温固定45 min；PBS清洗2次，用相应抗体于室温避光进行细胞内标记30 min。用流式细胞仪检测总Treg细胞（CD4+CD25hiCD127low）占比，CD45RA+Treg（rTreg）、CD45RO+Treg（eTreg）比例，计算eTreg/rTreg比值。
1.3 RT-qPCR检测miRNA-24水平提取血浆总RNA，并用微量核酸蛋白仪测定RNA纯度。将纯度符合要求的RNA反转录为cDNA，引物序列见表 1。采用2﹣ΔΔCt法计算miRNA-24的相对表达水平，其中ΔCt＝Ct目的基因－CtU6，ΔΔCt＝ΔCtT1DM组－ΔCt对照组。
| 引物名称 | F (5'-3') | R (5'-3') |
| miR-24 | UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG | GUUCCUGCUGAACUGAGCCAUU |
| U6 | CTCGCTTCGGCAGCACA | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
所有血清样品用ELISA试剂盒（Bio-Techne）提供的稀释剂按1∶2稀释后，依据试剂盒说明书进行检测，通过6点校准曲线从标准曲线直接估计血清mTOR浓度。
1.5 统计学处理采用SPSS 22.0及PRISM 9.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验。采用Pearson法分析miRNA-24及mTOR与T1DM患者Treg细胞亚群比例的相关性。检验水准（α）为0.05。
2 结果2.1 PBMC中Treg及其亚群比例比较结果（表 2）显示：两组总Treg比例差异无统计学意义。两组eTreg、rTreg亚群占总Treg细胞的比例差异有统计学意义（P＜0.05）；T1DM组eTreg/rTreg比值小于对照组（P＜0.05）。
| n＝40, x±s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | T1DM组 | 对照组 | t值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
| Treg/% | 7.63±1.46 | 7.98±1.99 | 0.89 | 0.38 | |||||||||||||||||||||||||
| eTreg/% | 2.39±0.93 | 3.17±1.77 | 2.48 | 0.02 | |||||||||||||||||||||||||
| rTreg/% | 4.91±1.49 | 4.08±1.64 | 2.35 | 0.02 | |||||||||||||||||||||||||
| eTreg/rTreg比值 | 0.57±0.37 | 1.32±2.22 | 2.11 | 0.04 | |||||||||||||||||||||||||
结果（表 3）显示：T1DM患者血浆中miRNA-24表达水平低于对照组（P＜0.001）；T1DM组血浆中mTOR表达水平高于对照组（P＝0.04）。
| n=40, x±s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | T1DM组 | 对照组 | t值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
| miRNA-24 | 1.81±0.38 | 2.26±0.42 | 4.97 | ＜0.001 | |||||||||||||||||||||||||
| mTOR/ (ng·mL﹣1) | 5.05±3.03 | 3.69±2.83 | 2.08 | 0.04 | |||||||||||||||||||||||||
| mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。 | |||||||||||||||||||||||||||||
按糖尿病抗体阳性数将T1DM患者分为单抗体亚组及多抗体（≥2个抗体）亚组，结果（表 4）显示：两亚组间miRNA-24水平、mTOR水平、总Treg及其亚群比例、eTreg/rTreg比值差异均无统计学意义。
| 指标 | 单抗体亚组 （n=23） |
多抗体亚组 （n=17） |
t值 | P值 |
| miRNA-24 | 1.88±0.39 | 1.71±0.37 | 1.41 | 0.17 |
| mTOR/ (ng·mL﹣1) | 4.76±2.44 | 5.44±3.72 | 0.69 | 0.49 |
| Treg/% | 7.96±1.01 | 7.39±1.71 | 1.22 | 0.23 |
| eTreg/% | 2.31±0.93 | 2.58±0.70 | 1.02 | 0.31 |
| rTreg/% | 4.81±1.64 | 5.04±1.06 | 0.49 | 0.62 |
| eTreg/rTreg比值 | 0.59±0.31 | 0.55±0.36 | 0.42 | 0.68 |
| mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；Treg；调节性T细胞；eTreg：效应Treg细胞；rTreg：静息Treg细胞。 | ||||
T1DM患者的糖化血红蛋白为（8.29±1.19）%，按糖化血红蛋白7.5%为切点，分成血糖控制良好亚组（糖化血红蛋白＜7.5%）及血糖控制不佳亚组（糖化血红蛋白≥7.5%），结果（表 5）显示：两亚组间miRNA-24水平、mTOR水平、总Treg及其亚群比例、eTreg/rTreg比值差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
| 指标 | 血糖控制良好亚组 （n=11） |
血糖控制不佳亚组 （n=29） |
t值 | P值 |
| miRNA-24 | 2.12±0.45 | 1.69±0.28 | 3.67 | ＜0.001 |
| mTOR/ (ng·mL﹣1) | 3.35±1.81 | 5.69±3.17 | 2.32 | 0.03 |
| Treg/% | 7.04±1.09 | 7.99±1.35 | 2.09 | 0.04 |
| eTreg/% | 1.96±1.20 | 2.60±0.59 | 2.26 | 0.03 |
| rTreg/% | 4.20±1.79 | 5.17±1.17 | 2.03 | 0.04 |
| eTreg/rTreg比值 | 0.80±0.32 | 0.50±0.30 | 2.84 | 0.007 |
| mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；Treg；调节性T细胞；eTreg：效应Treg细胞；rTreg：静息Treg细胞。 | ||||
结果（图 1）显示：T1DM患者血浆中miRNA-24与eTreg（r＝0. 40，P＝0.01）、eTreg/rTreg比值（r＝0.66，P＜0.001）正相关，与rTreg负相关（r＝﹣0. 69，P＜0.001）；mTORc与eTreg（r＝﹣0.32，P＝0.04）、eTreg/rTreg比值（r＝﹣0.40，P＝0.01）负相关，与rTreg正相关（r＝0. 48，P＝0.001）。
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| 图 1 T1DM患者血浆中miRNA-24、mTOR与Treg亚群的相关性分析 mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；Treg；调节性T细胞；eTreg：效应Treg细胞；rTreg：静息Treg细胞。 |
T1DM的发病率在全球呈上升趋势。全球T1DM患病人数在2017年达900万，占糖尿病患病总人数的2%[15]。T1DM是一种T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病。T1DM小鼠Treg细胞在体外免疫抑制活性明显减低，且凋亡水平增高[16]。但与健康对照组相比，T1DM患者Treg细胞数量未发生明显变化[17]。Treg细胞亚群失衡会引起T细胞异常活化并增殖，从而加速胰岛β细胞损伤。Faustman等[18]研究发现，T1DM患者T细胞存在与CD45蛋白及其剪接变体CD45RA和CD45RO相关的激活缺陷。本研究也发现，与健康人群相比，T1DM患者PBMC中Treg比例无明显变化，但Treg存在上述激活缺陷，表现为rTreg数量增加、eTreg数量减少，eTreg/rTreg比值减小。这与其他免疫疾病（如狼疮[19]）患者的表现相似。
miRNA在胰岛细胞分化、数量和功能维持方面都发挥重要作用。在小鼠胰腺发育早期敲除Dicerl基因后，小鼠胰岛β细胞数量减少为不及正常小鼠的10%，其机制可能为miRNA-24等miRNA表达水平降低，使胰岛素相关转录抑制因子Bhlhe22和Sox6蛋白表达増加[20]。本研究中，T1DM患者外周血miRNA-24表达减少，与Samandari等[21]的研究相似。但也有研究[22]显示，T1DM患者外周血中miRNA-24的表达增加。T1DM患者miRNA-24表达增加可能与其血糖控制不佳有关[23]。本研究亚组分析显示，血糖控制良好的T1DM患者外周血中miRNA-24浓度高于血糖控制不佳者。另有研究[23]显示，miRNA-24与T1DM患者血浆中C肽残存存在相关性。但本研究未发现T1DM患者不同阳性抗体数量亚组间miRNA-24表达差异，可能与纳入患者病程较长有关。
mTOR是存在于胞质中一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶家族（PIKK）。Treg细胞的免疫抑制功能受到PI3K/mTOR通路的严密调控，PI3K/mTOR通路的抑制或过度激活均影响Treg细胞的稳定和功能[11]。mTOR会诱导一些胞内代谢物，如法尼基焦磷酸盐、香叶基焦磷酸盐的产生，通过表观修饰改变叉头状转录因子成员Foxp3的表达，进而促进eTreg细胞的增殖与存活[24]，而增强TCR信号强度相关转录因子可促进eTreg细胞的分化[25]。本研究发现，T1DM患者血浆中mTOR浓度升高，与eTreg比例正相关，与上述研究结论相似。此外，Duan等[26]的研究显示，mTOR会通过糖酵解和脂质氧化途径来影响T细胞分化和效应，进而对胰岛细胞自身免疫进行调控，达到调控血糖的作用。本研究进一步的亚组分析中，血糖控制良好的T1DM患者血浆中mTOR浓度低于血糖控制不佳者，且Treg亚群分布存在差异。但是，本研究未发现T1DM患者不同阳性抗体数量亚组间mTOR表达差异，可能与本研究中患者病程大多超过3年、部分抗体滴度下降有关。
综上所述，本研究显示，T1DM患者PBMC中Treg亚群发生变化，同时miRNA-24表达减少、mTOR表达增加，且与血糖控制存在一定关系；miRNA-24、mTOR均与Treg亚群、eTreg/rTreg比值存在相关性，提示miRNA-24、mTOR可能参与Treg调节，导致T1DM患者免疫失调。今后需增加样本量，采用多中心研究验证本研究结论，并通过细胞实验和动物实验深入探讨miRNA-24、mTOR参与T1DM患者免疫调节的机制。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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