2023, Vol. 30
2. 上海市老年医学中心呼吸与危重症医学科，上海 201104;
3. 上海市呼吸病研究所，上海 200032;
4. 复旦大学附属中山医院胸外科，上海 200032
2. Department of Pulmonary Medicine, Shanghai Geriatric Medical Center, Shanghai 201104, China;
3. Shanghai Respiratory Research Institute, Shanghai 200032, China;
4. Department of Thoracic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
肺癌是目前全球发病率最高，同时致死率最高的癌症，5年生存率仅为10%~20%[1]。在非小细胞肺癌中，肺腺癌是最常见的组织学类型，占40%~50%[2-3]。虽然早期肺腺癌患者在根治性切除术后可获得较好预后，但患者在确诊时常已发生转移，因此总体预后较差[4]。
在40%~60%的亚洲肺腺癌患者中检测出表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变[5]。而靶向突变EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）可延长该类患者的生存期[6]。但是，部分患者在应用TKIs治疗约1年后出现耐药[7]。对于这部分患者，寻找新的治疗靶点具有重要意义。
通过干预肿瘤免疫抑制细胞（如肿瘤相关性巨噬细胞、调节性T细胞等），可提高抗肿瘤免疫作用或抵抗肿瘤耐药[8]。白介素34（interleukin-34, IL-34）是调节肿瘤微环境的重要细胞因子之一，已被证实在骨肉瘤[8]和肝癌[9]中通过招募肿瘤相关性巨噬细胞促进肿瘤的进展和转移。另有研究[10]表明，IL-34阻断剂联合PD-1抑制剂对肺腺癌具有潜在的治疗效果。本研究通过分析EGFR突变肺腺癌中IL-34的表达情况，评估其预后预测价值，以期为肺腺癌EGFR-TKIs耐药寻找新的治疗靶点。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2015年7月1日至2017年12月31日在复旦大学附属中山医院胸外科行肿瘤根治性手术切除的144例肺腺癌住院患者的手术标本。入选标准：（1）手术标本经复旦大学附属中山医院病理科诊断，确诊为肺腺癌；（2）基因检测示EGFR突变；（3）术前未接受过手术切除、化疗、免疫治疗、分子靶向治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：（1）合并血液系统疾病、其他恶性肿瘤、严重感染性疾病、凝血功能异常；（2）有远处转移。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2021-128），所有患者均签署知情同意书。
1.2 观察指标及随访收集患者性别、年龄、吸烟情况、手术方式、病理类型、肿瘤分化分级、脏层胸膜侵犯情况及EGFR基因检测结果。采取电话随访与门诊复查相结合的方式对肺腺癌患者进行随访，随访至2022年9月25日。总生存期定义为手术日期至死亡日期的间隔时间，或手术日期至最后1次随访日期的间隔时间；无复发生存期定义为手术日期至复发的间隔时间。
1.3 免疫组织化学检测及评估在石蜡标本上标记出肺腺癌组织和其对应的癌旁组织，用直径2.0 mm的组织穿刺针穿取石蜡标本。将取得的组织芯条与蜡块加热融合，制备成组织阵列，并以4 μm切片，固定于载玻片上。
根据免疫组织化学检测试剂盒说明书，将组织芯片于烘箱烘干，二甲苯脱蜡，100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇水化。滴加内源性过氧化物酶、抗原修复液，5%胎牛血清封闭；滴加按1∶500浓度稀释的IL-34抗体（abcam，ab224734），于4 ℃冰箱孵育12 h；加入二抗，室温孵育30 min后加入显色剂。结果由两位经验丰富的病理医师进行双盲评估。
根据肿瘤细胞IL-34染色强度及阳性比例进行评分。IL-34染色强度评分：无阳性染色（阴性表达）计0分，淡黄色（弱阳性）计1分，棕黄色（阳性）计2分，棕褐色（强阳性）计3分；阳性肿瘤细胞比例评分：阳性肿瘤细胞百分比≤25%计1分，26%~50%计2分，51%~75%计3分，76%~100%计4分。将染色强度评分与阳性肿瘤细胞比例评分相乘，乘积≤7判断为IL-34低表达，大于7判断为IL-34高表达。
1.4 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以n(%)表示，组间比较采用卡方检验。采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，并进行log-rank检验。采用Cox比例风险模型进行预后影响因素分析。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 患者总体情况144例患者中，男性54例、女性90例，年龄35~78岁，平均（58.14±9.12）岁。所有患者经基因检测判定为EGFR基因18、19、20或21外显子突变。免疫组织化学检测（图 1）显示：IL-34在肺腺癌癌组织中的表达强于周围正常肺组织。肺腺癌癌组织中IL-34高表达者93例、IL-34低表达者51例。
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| 图 1 IL-34在EGFR突变肺腺癌中的表达情况 A、B：IL-34高表达肺癌组织（A）及其对应的癌旁组织（B）；C、D：IL-34低表达肺癌组织（C）及其对应的癌旁组织（D）。Original magnification：×200。 |
结果（表 1）显示：IL-34低表达组与高表达组患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤大小、肿瘤分化程度、脏层胸膜侵犯情况、TNM分期差异均无统计学意义。
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | 总计 | 低表达组 (n＝51) |
高表达组 (n＝93) |
P值 | |||||||||||||||||||||||||
| 性别 | 0.113 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 男 | 54 | 23(42.6) | 31(57.4) | ||||||||||||||||||||||||||
| 女 | 90 | 28(31.1) | 62(68.9) | ||||||||||||||||||||||||||
| 年龄 | 0.173 | ||||||||||||||||||||||||||||
| ＜60岁 | 74 | 23(31.1) | 51(68.9) | ||||||||||||||||||||||||||
| ≥60岁 | 70 | 28(40.0) | 42(60.0) | ||||||||||||||||||||||||||
| 吸烟情况 | 0.253 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 是 | 39 | 16(41.0) | 23(59.0) | ||||||||||||||||||||||||||
| 否 | 105 | 35(33.3) | 70(66.7) | ||||||||||||||||||||||||||
| 肿瘤最大径* | 0.145 | ||||||||||||||||||||||||||||
| ＜3 cm | 92 | 36(39.1) | 56(60.9) | ||||||||||||||||||||||||||
| ≥3 cm | 52 | 15(28.8) | 37(71.2) | ||||||||||||||||||||||||||
| 肿瘤分化程度 | 0.180 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ⅰ+Ⅱ级 | 125 | 42(33.6) | 83(66.4) | ||||||||||||||||||||||||||
| Ⅲ级 | 19 | 9(47.4) | 10(52.6) | ||||||||||||||||||||||||||
| 侵犯脏层胸膜 | 0.386 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 是 | 98 | 36(36.7) | 62(63.3) | ||||||||||||||||||||||||||
| 否 | 46 | 15(32.6) | 31(67.4) | ||||||||||||||||||||||||||
| TNM分期 | 0.372 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ⅰ期 | 75 | 28(37.3) | 47(62.7) | ||||||||||||||||||||||||||
| Ⅱ+Ⅲ期 | 69 | 23(33.3) | 46(66.7) | ||||||||||||||||||||||||||
| *T1分期肺癌最大径＜3 cm。 | |||||||||||||||||||||||||||||
患者的中位随访64（42，73）个月，1年、3年、5年总生存率分别为92%、76%和63%，1年、3年、5年累积复发率分别为16%、29%、32%。Kaplan-Meier生存分析（图 2）显示：IL-34低表达组患者的1年、3年、5年总生存率分别为92%、88%、80%，累积复发率分别为8%、17%和19%；IL-34高表达组患者的1年、3年、5年总生存率分别为92%、70%、53%，累积复发率分别为20%、35%、40%。IL-34高表达组患者总生存率低于IL-34低表达组（P＝0.006），累积复发率高于低表达组（P＝0.011）。
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| 图 2 Kaplan-Meier分析IL-34表达与EGFR突变肺腺癌患者预后的关系 |
单因素Cox比例风险模型分析（表 2）显示，肿瘤大小、IL-34表达与患者术后生存相关（P＜0.01）；肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期、IL-34表达与患者术后复发相关（P＜0.05）。将单因素分析中差异有统计学意义（P＜0.05）的指标纳入多因素分析，结果（表 3）显示：肿瘤最大径≥3 cm、IL-34表达增加提示患者术后生存时间较短（P＜0.05）；肿瘤分化程度分级越高、TNM分期越高、IL-34表达增加提示术后复发率较高（P＜0.05）。
| 变量 | 总生存 | 无复发生存 | |||
| HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P值 | ||
| 年龄（≥60岁vs＜60岁） | 1.406(0.830~2.382) | 0.204 | 1.126(0.619~2.047) | 0.698 | |
| 性别（男vs女） | 1.014(0.590~1.742) | 0.959 | 0.922(0.500~1.699) | 0.795 | |
| 吸烟史（是vs否） | 0.886(0.484~1.623) | 0.693 | 1.143(0.596~2.192) | 0.690 | |
| 肿瘤大小（≥3 cm vs＜3 cm） | 2.241(1.325~3.789) | 0.003 | 2.073(1.138~3.775) | 0.019 | |
| 肿瘤分化程度（Ⅲ级vs Ⅰ+Ⅱ级） | 1.712(0.885~3.310) | 0.131 | 2.624(1.289~5.340) | 0.015 | |
| 侵犯脏层胸膜（是vs否） | 0.753(0.438~1.294) | 0.310 | 0.594(0.324~1.090) | 0.099 | |
| TNM分期（Ⅱ+Ⅲ期vs Ⅰ期） | 1.433(0.846~2.427) | 0.179 | 2.847(1.502~5.395) | 0.001 | |
| IL-34表达水平（高vs低） | 2.364(1.247~4.480) | 0.008 | 2.490(1.193~5.197) | 0.015 | |
| 变量 | 总生存 | 无复发生存 | |||
| HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P值 | ||
| 肿瘤大小（≥3 cm vs＜3 cm） | 2.114(1.247~3.581) | 0.005 | 1.349(0.705~2.580) | 0.366 | |
| 肿瘤分化程度（Ⅲ级vs Ⅰ+Ⅱ级） | NA | NA | 2.309(1.100~4.845) | 0.027 | |
| TNM分期（Ⅱ+Ⅲ期vs Ⅰ期） | NA | NA | 2.515(1.303~4.857) | 0.007 | |
| IL-34表达水平（高vs低） | 2.218(1.168~4.212) | 0.015 | 2.486(1.168~5.290) | 0.018 | |
IL-34是集落刺激因子1受体（colony-stimulating factor-1 receptor, CSF-1R）的配体[11]，作为肿瘤微环境调节因子之一，可以促进炎性细胞因子分泌，激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和JNK（c-Jun N-terminal kinase）相关信号通路[12-14]，招募巨噬细胞并调节其分化[15]，介导肿瘤细胞免疫逃逸及调控肿瘤微环境，进而促进肿瘤的进展和转移。其中，巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤免疫调控中发挥重要作用[16]。
TKIs可改善EGFR突变肺癌患者的预后，总体反应率为60%~80%[17-18]。但部分患者在应用TKIs治疗约1年后出现耐药。深入探讨肿瘤的异质性和耐药机制有利于防止耐药克隆的出现[19]。EGFR-TKIs获得性耐药的常见机制包括MET扩增、HER2扩增、RAS/MAPK通路蛋白突变、PI3K通路蛋白突变等[20]。Blakely等[21]的研究表明，NF-κB通路可通过调控IL-6、IL-8等细胞因子介导肺腺癌EGFR-TKIs的耐药，表明白介素在EGFR-TKIs获得性耐药中发挥重要作用。另有研究[22]显示，IL-34可通过调控肿瘤相关性巨噬细胞的功能来介导肺癌的化疗耐药。同时，在人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft, PDX）模型中，通过联合使用IL-34抗体可以显著提高免疫治疗效果[10]，提示IL-34在肿瘤微环境中扮演重要的免疫抑制角色。
本研究中，IL-34蛋白在EGFR突变肺腺癌患者的癌组织中相对高表达，而在正常肺组织中低表达，与既往研究[21]相符；Kaplan-Meier生存分析结果表明，高表达IL-34患者的5年总生存率降低，而累积复发率升高；Cox比例风险模型分析表明，IL-34表达升高为该类患者生存期缩短、复发率升高的独立预测因子（P＜0.05）。但是本研究目前仅检测IL-34在EGFR突变肺腺癌中的表达情况，而未探讨IL-34对EGFR突变肺腺癌肿瘤微环境的调控作用及其对相关通路的影响。此外，Passaro等[23]的研究证实，联合化疗、抗血管生成药物等有助于延迟EGFR-TKIs耐药的发生。因此深入探讨IL-34抗体联合EGFR-TKIs及其他治疗方案的治疗效果，可能为TKIs耐药肿瘤患者提供有效的治疗方案。
综上所述，本研究提示，IL-34可用于预测EGFR突变肺腺癌患者的术后预后。IL-34有望成为EGFR突变肺腺癌患者的治疗新靶标。后续须进一步探讨IL-34对EGFR突变肿瘤微环境及相关通路的作用，以及与EGFR-TKIs联合治疗效果，从而辅助EGFR突变肺腺癌患者尤其是EGFR-TKIs耐药患者诊治。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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