2023, Vol. 30
2. 海军特色医学中心肾脏科，上海 2012033;
3. 复旦大学附属金山医院临床医学研究中心，上海 200032
2. Department of Nephrology, Navy Characteristic Medical Center, Shanghai 2012033, China;
3. Clinical Medical Research Center, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)起源于中胚层，可从脂肪、骨髓和脐带等组织中分离出来。MSCs具有自我更新、多向分化、免疫原性低及成瘤风险小的优点，是干细胞治疗的安全来源，可用于血液系统疾病、自身免疫性疾病、肺部感染、糖尿病肾病等的治疗[1-2]。目前应用MSCs治疗疾病的临床研究均需体外大量扩增MSCs。但MSCs在体外不断扩增过程中会逐渐衰老，且在移植到体内后，复杂内环境(如高糖)会使其衰老加速、增殖变慢，从而影响疗效[3]。
MSCs衰老主要表现为细胞增大或呈颗粒形态，增殖和分化能力不足，SA-β-Gal活性升高。细胞衰老是一个复杂且不可逆的过程，与氧化应激、DNA损伤、端粒缩短、致癌基因激活及线粒体功能受损[4]密切相关。衰老严重影响干细胞多向分化能力，增加其突变风险，严重制约疗效。自噬及动力学维持是线粒体质量控制和维持细胞能量平衡的重要因素。线粒体受损积累及自噬抑制均可诱导细胞衰老损伤[5]。
黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ，Ast)和黄芪总苷能延缓氢化可的松诱导的衰老前期大鼠衰老进程，可能与两者参与抗氧化和调节免疫有关[6]。Ast可通过调控氧糖剥夺再灌注模型离体神经干细胞中低氧诱导因子1α与血管内皮生长因子表达，提高其增殖与分化能力，进而修复受损神经[7]。Ast可抑制造血干细胞的衰老，促进造血干细胞增殖[8]。
本课题组前期研究[9]发现，人脂肪源性干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)移植可改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿，从而延缓其肾脏病进展，且经Ast干预后疗效更显著，但具体机制尚不清楚。因此，本文通过体外细胞实验，模拟糖尿病肾病宿主体内的高糖环境，从线粒体自噬角度探讨Ast对高糖环境下hADSCs衰老的延缓作用，为后续Ast提高干细胞疗效相关研究提供基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料及仪器hADSCs购自美国ATCC公司。Ast购自中国药品生物制品检定所。其他试剂包括hADSC培养液(GIBCO，10567-014)、成人脂肪间充质干细胞专用胎牛血清(GIBCO，12664-025)、胰酶(Cyagen)、CCK8试剂盒(Dojindo)，p16(Abcam，ab189034)、帕金森蛋白(Parkin；Invitrogen，PA1-751)、同源性磷酸酶-张力蛋白诱导激酶1(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, Pink1; Proteintech，23274-1-AP)、微管相关蛋白轻链3(LC3；Cell Signaling Technology，3868s)、p62(Cell Signaling Technology，23214s)抗体。仪器包括正置光学显微镜(尼康，ECLIPSE CI)、酶标仪(上海科华，ST-360)、qRT-PCR仪(ABI，7900HT)、医用X射线暗匣[广东粤华，5 in×7 in(1 in=2.54 cm)]、激光扫描仪(EPSON，Perfection V39)、透射电镜(HITACHI，HT7800或HT7700)。实验于2020年6月至2021年12月在复旦大学附属金山医院临床试验中心完成。
1.2 葡萄糖与Ast干预浓度选择 1.2.1 葡萄糖浓度取生长状态良好的hADSCs，以每孔3 000个细胞接种于96孔板，培养基中分别加入5.5、15、20、25、30、35 mmol/L葡萄糖(n=3)，用10% FBS于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h、96 h。通过CCK8法检测各时间点细胞增殖情况，选择最适高葡萄糖浓度。
1.2.2 Ast浓度取生长状态良好的hADSCs，以每孔3 000个细胞接种于96孔板，分别加入10、20、30、40 mg/L Ast(以20 g/L储存于DMSO中)及19.5 mmol/L甘露醇(n=3)，用10% FBS于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h。通过CCK8法检测各时间点细胞增殖情况，选择最适Ast干预浓度。
1.3 细胞培养、干预及活性检测选取第3~5代hADSCs进行实验，随机分为4组：对照组给予含5.5 mmol/L葡萄糖的培养液培养；甘露醇组予含5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇的培养液培养；高糖组予含最适高浓度葡萄糖的培养液培养；Ast组予含最适高浓度葡萄糖+最适浓度Ast培养。4组均培养72 h后消化收集hADSCs。采用CCK8法(试剂盒购自Dojindo)检测hADSCs增殖能力；用SA-β-Gal染色法(试剂盒购自Beyotime)检测hADSCs衰老情况；采用Annexin Ⅴ-FITC/PI(试剂盒购自BD)检测hADSCs凋亡情况。
1.4 qRT-PCR检测线粒体自噬相关基因表达取第3~5代hADSCs，以每孔1.26×105个细胞接种于6孔板(分组同上)。TRIzol法提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒操作步骤反转录为cDNA，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成(引物序列见表 1)；反应条件：50℃2 min、95℃ 10 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s，40个循环。扩增数以2-ΔΔCt表示。
| 基因名称 | F (5'-3') | R (5'-3') |
| p16 | CTTCCTGGACACGCTGGT | GCATGGTTACTGCCTCTGGT |
| Pink1 | CCAGGCAATTTTTACCCAGA | AATGTAGGCATGGTGGCTTC |
| Parkin | GCAGAGACCGTGGAGAAAAG | AATGTAGGCATGGTGGCTTC |
| LC3 | GATGTCCGACTTATTCGAGAGC | TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA |
| p62 | CACCTGTCTGAGGGCTTCTC | CGATGGACCAGAAGCTGATT |
| Pink1：同源性磷酸酶-张力蛋白诱导激酶1；Parkin：帕金森蛋白；LC3：微管相关蛋白轻链3。 | ||
按照全细胞裂解液说明书提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。电泳、转膜、封闭，加一抗，4℃过夜；TBST洗膜，加入对应二抗，孵育2 h，洗膜后用ECL显色，以β-actin作为内参计算各蛋白的相对表达量。
1.6 透射电镜观察线粒体及自噬小体情况离心收集细胞，去培养基加入电镜固定液，重悬混匀后4℃固定(2~4 h)、保存及运输。琼脂预包埋后固定，室温脱水，渗透包埋，聚合，超薄切片，染色，透射电子显微镜下观察，采集图像并分析。
1.7 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行统计分析，用Graphpad Prism 6.02制作统计图。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用LSD法，检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 葡萄糖及Ast干预浓度 2.1.1 葡萄糖浓度CCK8结果(图 1)显示：20、25、30、35 mmol/L组各时间点hADSCs增殖能力均低于5.5 mmol/L组(P＜0.01)。培养24 h、48 h、72 h、96 h时，随着培养基中葡萄糖浓度的增加，hADSCs增殖能力减弱；各时间点20、25、30、35 mmol/L组间hADSCs增殖能力差异均无统计学意义。培养基中葡萄糖浓度≤25 mmol/L时，随着培养时间延长，hADSCs增殖能力逐渐增强；培养基中葡萄糖浓度＞25 mmol/L时，该趋势减弱。因此，高葡萄糖浓度选择25 mmol/L。
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| 图 1 CCK8法检测不同浓度葡萄糖培养不同时间时hADSCs增殖情况 1~6：葡萄糖5.5、15、20、25、30、35 mmol/L。A~D：不同浓度葡萄糖培养24 h (A)、48 h (B)、72 h (C)、96 h (D)时hADSCs增殖情况；E：随培养时间延长，hADSCs增殖趋势。n=3，x±s；**P＜0.01与5.5 mmol/L组相比。 |
CCK8结果(图 2)显示：Ast 20、30、40 mg/L组各时间点hADSCs增殖能力均高于葡萄糖25 mmol/L组(P＜0.01)。培养基中Ast浓度为20、30、40 mg/L时，随着培养时间延长，hADSCs增殖能力逐渐增强。各时间点Ast 20、30 mg/L组间hADSCs增殖能力差异均无统计学意义；Ast 40 mg/L组增殖能力弱于Ast 20 mg/L，培养48 h时差异有统计学意义(P＜0.01)。因此，Ast浓度选择20 mg/L。高糖环境下，随着Ast干预时间的延长，hADSCs的增殖能力逐渐升高，干预72 h时达高峰，因此干预时间选择72 h。
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| 图 2 CCK8法检测不同浓度Ast对高糖环境下hADSCs增殖的影响 1~7：葡萄糖5.5 mmol/L，甘露醇19.5 mmol/L，葡萄糖25 mmol/L，Ast 10、20、30、40 mmol/L。A~C：不同浓度Ast干预24 h (A)、48 h (B)、72 h (C)后hADSCs增殖情况；D：随干预时间延长，hADSCs增殖趋势。n=3，x±s；**P＜0.01与葡萄糖25 mmol/L组相比；△△P＜0.01与Ast 20 mg/L组相比。 |
Annexin Ⅴ-FITC/PI结果(图 3A)显示：与对照组比较，高糖组及Ast组hADSCs凋亡率均升高(P＜0.001)；与高糖组比较，Ast组hADSCs凋亡率降低(P＜0.001)。
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| 图 3 Ast对高糖环境下hADSCs凋亡、衰老的影响 1：对照组；2：甘露醇组；3：高糖组；4：黄芪甲苷组。A：Annexin Ⅴ-FITC/PI结果；B、C：SA-β-Gal染色(×100)结果；D：qRT-PCR检测p16 mRNA表达；E、F：Western印迹检测p16蛋白表达。n=3，x±s; *P＜0.05、***P＜0.001与对照组相比，△△△P＜0.001与高糖组相比。 |
SA-β-Gal染色(图 3B、图 3C)显示：对照组、甘露醇组、高糖组、Ast组中衰老细胞百分比分别为(1.72±0.56)%、(1.50±0.32)%、(15.66±2.21)%、(2.78±0.11)%。与对照组比较，高糖组中衰老细胞百分比升高(P＜0.001)，Ast组无明显改变；与高糖组比较，Ast组衰老细胞百分比降低(P＜0.001)。qRT-PCR与Western印迹结果(图 3D~3F)显示：与对照组比较，高糖组与Ast组p16 mRNA及蛋白表达均增加(P＜0.05)；与高糖组比较，Ast组p16 mRNA及蛋白表达减少(P＜0.001)。
2.4 Ast对高糖环境下hADSCs线粒体自噬的影响 2.4.1 qRT-PCR及Western印迹检测相关分子表达结果(图 4)显示：与对照组比较，高糖组LC3 mRNA表达减少、LC3轻链蛋白Ⅱ与Ⅰ比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)减小，Ast组LC3 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ增加，差异均有统计学意义(P＜0.001)；与高糖组比较，Ast组LC3 mRNA及蛋白表达增加(P＜0.001)。与对照组比较，高糖组、Ast组p62 mRNA及蛋白表达均增加(P＜0.01)；与高糖组比较，Ast组p62 mRNA及蛋白表达减少(P＜0.001)。与对照组比较，高糖组、Ast组Pink1及Parkin的mRNA及蛋白均减少(P＜0.001)；与高糖组比较，Ast组Pink1及Parkin mRNA及蛋白表达增加(P＜0.01)。
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| 图 4 Ast对高糖环境下hADSCs线粒体自噬相关分子表达的影响 1：对照组；2：甘露醇组；3：高糖组；4：黄芪甲苷组。A~D：qRT-PCR结果；E~I：Western印迹结果。Pink1：同源性磷酸酶-张力蛋白诱导激酶1；Parkin：帕金森蛋白；LC3：微管相关蛋白轻链3。n=3，x±s；**P＜0.01、***P＜0.001与对照组相比；△△P＜0.01、△△△P＜0.001与高糖组相比。 |
结果(图 5)显示：培养72 h时，对照组及甘露醇组可见大量形态正常的线粒体，线粒体嵴排列整齐；高糖组线粒体肿胀变形、体积变大，基质及嵴断裂、呈空泡状，可见双层膜结构的自噬体及单层膜结构的自噬溶酶体；Ast组线粒体肿胀变形减轻、体积较高糖组减小，基质及线粒体嵴断裂减轻，可见较多形态正常的线粒体、双层膜结构的自噬体及单层膜结构的自噬溶酶体。
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| 图 5 透射电镜观察hADSCs中线粒体自噬情况 红色箭头表示线粒体；蓝色箭头表示自噬体；黄色箭头表示自噬溶酶体。 |
干细胞疗法为糖尿病及糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等糖尿病并发症的治疗带来希望[10]。其机制主要与干细胞营养及旁分泌作用，而非转分化作用相关[11]。细胞疗法主要挑战为细胞移植效率及安全性不高。干细胞在宿主体内的移植效率受内环境影响，如：高糖会抑制骨髓MSCs的增殖和迁移[12]，抑制牙周韧带干细胞增殖和分化为成骨细胞[13]，降低MSCs的增殖能力[3]。高糖环境下干细胞的生存能力降低为干细胞治疗糖尿病及其并发症受限的主要原因[14]。本研究显示，随着葡萄糖浓度的增加，hADSCs的增殖能力减弱、凋亡及衰老增加。
Ast是黄芪的主要成分，具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗高血压、抗哮喘和抗纤维化特性[15]。Ast能通过促进自噬来抑制细胞凋亡，进而保护脑缺血/再灌注损伤[16]，或减轻糖尿病周围神经病变[17]。Ast广泛用于肾脏疾病，如急性肾损伤[18]和糖尿病肾病[19]。本课题组前期研究[9]表明，Ast孵育的hADSCs改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿，进而减轻肾损伤的效果更好，但具体机制不清楚。本研究体外细胞实验表明，与高糖组比较，Ast组hADSCs凋亡率降低，SA-β-Gal阳性细胞减少，衰老相关蛋白p16表达降低(P＜0.001)。
线粒体功能与干细胞功能密切相关，且线粒体功能障碍是机体衰老的标志之一。线粒体功能障碍及线粒体自噬异常与细胞衰老密切相关[5]。高糖能通过抑制多种细胞中线粒体自噬，减弱细胞增殖，促进凋亡[20-21]。2005年Lemasters[22]首次提出“线粒体自噬”学说。线粒体自噬是细胞清除受损线粒体的重要途径，是线粒体质量控制及氧化应激的重要组成部分。Pink1和Parkin可选择性地将功能失调或受损的线粒体通过自噬途经清除，对于线粒体清除非常重要[23]。Zhou等[24]的研究显示，三七皂苷R1能抑制高糖环境下rMC-1和db/db小鼠视网膜细胞的凋亡，该作用主要与三七皂苷R1上调Pink1和Parkin表达、提高LC3Ⅱ/Ⅰ比值、下调p62/SQSTM1水平有关。Zhu等[25]的研究则显示，MSCs能通过Pink1/Parkin途径改善线粒体自噬，从而减轻高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。
本实验中，高糖组hADSCs中线粒体自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ减小，Pink1及Parkin表达减少，p62表达增加；电镜下可见线粒体肿胀变形、体积增大、基质及嵴断裂，自噬体较少。Ast组hADSCs中LC3Ⅱ/Ⅰ、Pink1及Parkin水平升高，p62表达减少；电镜下可见线粒体肿胀变形减轻、体积较小、基质及嵴断裂减轻，自噬体较多。该结果证明，高糖能抑制线粒体自噬，而Ast可改善由高糖诱导的线粒体自噬能力减弱。
综上所述，本研究表明，随着葡萄糖浓度的升高，hADSCs的增殖能力减弱、凋亡及衰老增加，Ast可改善由高糖引起的hADSCs凋亡和衰老；进一步研究发现，高糖导致hADSCs中线粒体自噬相关分子表达改变，自噬能力减弱，而Ast干预后，线粒体自噬增强，提示Ast减轻高糖环境下干细胞衰老及凋亡的能力可能与增强Pink1/Parkin介导的线粒体自噬有关。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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