2023, Vol. 30
2. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心重症肝病科, 上海 201508
2. Department of Severe Hepatitis Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
2020年全球统计数据[1]显示，原发性肝癌发病率居肿瘤发病率的第6位，死亡率则高居第3位，每年有90万新发病例和83万死亡病例。原发性肝癌也是我国发病第4位的恶性肿瘤及排名第2位的肿瘤致死病因，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）占原发性肝癌总数的75%~85%，严重威胁我国人民的生命和健康[2]。由于起病隐匿，首次诊断时只有少于30%的HCC患者适合接受根治性治疗，因此，需要更深入地研究癌基因和抑癌基因及其相关信号通路在HCC发生和发展中的重要作用[3]。
自噬是通过适应各种应激条件来维持细胞内环境稳定的重要分解代谢过程，在肿瘤的发生发展也发挥重要作用[4]。肝脏高度依赖自噬来维持肝脏的正常功能，小鼠的遗传学研究[5]表明，自噬缺陷会导致肝脏肿大和肝脏肿瘤。自噬最初被认为是肿瘤抑制的一种机制，主要是因为自噬基因BECN1是肿瘤抑制因子，尤其在HCC中。BECN1敲基因小鼠出现3种自发性肿瘤，HCC为其中之一[6]。NFE2L2为一种转录因子，负责表达一系列抗氧化和解毒酶，在自噬缺陷的小鼠中，其活化将促进肿瘤的发生[7]。自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG)参与自噬小体的形成，维持正常的自噬活性必须对自噬相关基因的诱导进行严格的调控，但其在肝脏中的调控作用尚待阐明。
自噬相关基因5(autophagy-related gene 5, ATG5)参与自噬体的形成，对自噬功能至关重要[8]。肝脏特异性敲除ATG5基因促进p62介导的Nrf2稳定化，导致肝脏损伤、炎症、纤维化和自发性良性腺瘤[5, 9-10]。另一方面，自噬也会促进肿瘤的生长，这取决于肿瘤发展的不同阶段。在已形成的肿瘤中，自噬通过增加氨基酸、脂质和葡萄糖等形式的营养物质来满足肿瘤的代谢需求，进一步支持肿瘤的发展[6]。在一个通过敲除肿瘤抑制因子Palb2导致的遗传性乳腺癌的小鼠模型中发现，其等位基因自噬相关的Atg6/Beclin1同样出现缺失，导致小鼠的肿瘤缩小及延长生存时间，进一步激活p53通路，从而抑制肿瘤的生长[11-12]。在一个由致癌性K-rasG12D驱动的肺癌小鼠模型中，肿瘤细胞中ATG7的缺失激活了p53，减少了增殖，增加细胞死亡，并减少肿瘤负担[13]。同样在缺失ATG5的模型[14]中也有类似发现。而在HCC中，研究[15]发现超过50%的黄曲霉毒素B1诱发的HCC、约45%的HBV相关HCC和约13%的HCV相关HCC中都发现了p53突变。那么在HCC中ATG5是否影响p53信号通路促进HCC进展，尚需进一步研究。
本研究将探讨ATG5在HCC组织及HCC细胞系中的表达；在HCC细胞系中敲减ATG5基因，观察其对HCC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响；有参测序后，分析其对下游信号通路的影响，以期为ATG5是否可通过影响p53信号通路促进HCC发展提供参考及依据。
1 材料与方法 1.1 细胞株和数据库HCC细胞株（PLC/PRF/5、BEL-7402、SMCC-7721、HepG2、SK-Hep-1、Hep3B）和正常肝细胞株（L02）从中国科学院细胞库中获得，HCC细胞系MHCC97-H、MHCC97-L和HCCLM3通过复旦大学附属中山医院肝癌研究所分离获得。检索网络公共数据库的数据进行分析，TCGA数据可视化网站（http://ualcan.path.uab.edu），NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
1.2 小干扰素RNA的构建与转染针对ATG5和阴性对照组（NC）的小干扰RNA来自中国上海吉玛公司。小干扰RNA的目标序列如下：si-ATG5-1，GCUAUAUCAGGAUGAGAUATT（siRNA416）；si-ATG5-2，GCAGUGGC-UGAGUGAACAUTT（siRNA1106）。通过荧光定量PCR及蛋白电泳验证，si-ATG5-1和si-ATG5-2为有效的小干扰RNA片段。将小干扰RNA转染，使用Lipo2000转染试剂（Thermo公司，美国）。将MHCC97-H细胞按5×104细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后于37℃，5%CO2培养24 h，细胞被培养并达到40%~50%的融合度，将siRNA稀释到不含血清的培养基中。将Lipo2000转染试剂稀释到小干扰RNA中和其对照组中，快速涡旋10 s，孵育10 min，最后将形成的混合物加入细胞中。
1.3 免疫印迹实验在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Eagle培养基[维森特生物技术(南京)有限公司，中国]中培养实验所需细胞，提取蛋白后进行免疫印迹。用细胞刮收集处理好的细胞，加入RIPA缓冲液于冰上裂解30 min，4℃，12 000×g离心10 min。将上清液转移到1个新的离心管中，加入4×SDS上样缓冲液，100℃，加热10 min。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品（Bio-Rad公司，美国）。将蛋白质转移到PVDF膜（Millipore公司，美国），该膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，用特异性抗ATG5抗体于4℃孵育过夜（Santa Cruz公司，美国）。隔日，吸除液体，TBST清5次，每次间隔15 min，然后加入HRP结合的二抗，室温孵育1 h，TBST清洗5次，每次间隔15 min，使用ECL发光液显影。
1.4 CCK-8检测细胞活性将细胞重复接种于96孔板中，每孔4 000个细胞。混匀后于37℃及5%CO2培养24 h，细胞贴壁后，按完全培养基和CCK-820∶1的比例配置CCK-8溶液，96孔板每孔加入100 μL，每组5个重复，同时设置调零组，即直接在空孔中加入100 μL配置CCK-8溶液，避光培养2 h，酶标仪450 nm波长分别检测0 h的光密度（D）值。在转染后24 h、48 h、72 h，每孔加入用培养基稀释好100 μL CCK-8试剂（同仁化学，日本），在细胞培养箱中孵育40 min。使用多功能酶标仪（Thermo公司，美国）在450 nm处测量光密度。
1.5 划痕修复实验将这些细胞在6孔板中接种，每孔3个重复。当细胞几乎达到100%的融合时，用200 µL的移液枪的枪头尖端划伤单层细胞，产生交叉细胞伤口。用PBS洗涤细胞3次，以清除细胞碎片，并在不含胎牛血清的培养基中继续培养。用倒置显微镜观察0 h、72 h伤口闭合的速度。每条划痕在同一位置不同时段进行拍照，测量其间距，迁移率＝0 h间距与72 h间距差值/0 h间距，最后，比较两组细胞迁移率。
1.6 细胞Transwell实验为明确HCC细胞的侵袭功能变化，采用的5 μm孔径的聚碳酸酯膜Transwell小室（Corning公司，美国）。包被基底膜，用PBS 1∶10稀释50 mg/L Matrigel基质胶，取60 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，放37℃、5% CO2培养箱孵育4 h，吸弃上清。细胞转染至72 h后按5×103细胞/孔的浓度接种Transwell小室，下室加入血清浓度为20%的培养液700 μL，37℃ 5% CO2培养24 h。取出小室，PBS洗1次。加入预冷的无水乙醇，﹣20℃固定10 min。弃净无水乙醇，PBS洗1次。在PBS中用棉签轻轻刮去小室上表面的Matrigel胶，用PBS洗上表面3次。拿出小室倒置，风干。将小室放入1个新的24孔板中，加入300 μL 10%结晶紫，使膜浸没，37℃染色30 min。用一级纯水洗3次。小室风干后，放入孔中，倒置显微镜在200倍视野下取若干视野，使用ImageJ软件计数总穿膜细胞数，实验重复3次并进行统计。
1.7 转录组有参测序在MHCC97-H HCC细胞中，转染si-ATG5小干扰RNA，3个实验组样品，3个对照组。采用TRIzol试剂依照说明书提取总RNA，鉴定纯度和定量，评估完整性。采用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep试剂盒依照说明书构建转录组文库。采用llumina Novaseq6000测序平台对文库进行测序，采用fastp软件对fastq格式的raw reads进行处理。采用HISAT2软件进行参考基因组比对，并进行基因表达量FPKM计算，并通过HTSeq-count获得每个基因的reads计数（counts）。其中q值＜0.05筛选差异表达基因。使用R包ggradar绘制雷达图，对差异表达基因进行KEGG、Reactome、GO富集分析。采用GSEA软件进行基因集富集分析。
1.8 统计学处理采用GraphPad Prism 6.0进行统计学分析。采用双尾非配对t检验，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 HCC中ATG5的表达上调，并与p53的突变有关TCGA数据库的分析显示，ATG5 mRNA水平在HCC组织表达水平明显高于正常肝组织（图 1A，P＜0.000 1）。男性组或女性组HCC组织的ATG5表达水平均高于正常肝组织（P＜0.000 1），但男性组与女性组之间ATG5水平差异无统计学意义（图 1B，P＝0.56）。将不同分期的HCC患者进一步分组，结果（图 1C）显示，不同分期的HCC组织中ATG5水平均高于正常肝组织，且3期患者的ATG5水平高于1期患者（P＝0.013），提示ATG5表达水平与患者HCC分期有关。值得注意的是，p53突变组ATG5的表达水平高于非突变组（图 1D，P＜0.000 1）。在NCBI数据库中分析ATG5表达结果（图 1E）显示，ATG5在HCC组织中表达水平均高于正常肝组织。
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| 图 1 ATG5在HCC患者组织中表达 A：TCGA数据库中，ATG5在HCC组织和正常肝组织的mRNA表达水平；B：ATG5在男性和女性HCC患者的表达水平；C：ATG5在HCC患者不同分期的表达水平；D：ATG5在p53变异和非变异组的表达水平；E：N为正常肝组织；T为HCC组织。NCBI数据库中，ATG5在HCC组织和正常肝组织的mRNA表达水平。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。 |
结果（图 2）显示：与L02细胞相比，ATG5蛋白水平在所有检测的HCC细胞株中明显高表达，尤其在MHCC97-H、HCCLM3、Huh7和PLC/PRF/5异常高表达。这表明，ATG5可能是促进HCC细胞生长的癌基因。
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| 图 2 ATG5在HCC细胞株和正常肝细胞株中蛋白水平表达 1: L02; 2: SK-Hep-1; 3: SMMC-7721; 4: BEL-7402; 5: Hep3B; 6: HCCLM3; 7: Huh-7; 8: MHCC97-L; 9: MHCC97-H; 10: PLC/PRF/5。 |
利用小干扰RNA在MHCC97-H中敲减Atg5基因结果（图 3）显示，siRNA416和siRNA1106均能明显敲减ATG5基因在mRNA和蛋白水平的表达。在表达量最高的HCC细胞株（HCCLM3、MHCC97-H）中使用siRNA1106敲减ATG5。CCK8检测结果（图 4A、4B）显示，与空白对照组和阴性对照组相比，下调ATG5后HCC细胞增殖能力明显下降（P＜0.001）。划痕实验结果（图 4C、4D）显示，与空白对照组和阴性对照组相比，下调ATG5后HCC细胞迁移能力明显下降（P＜0.05）。Transwell实验结果（图 4E、4F）显示，与空白对照组和阴性对照组相比，下调ATG5后，HCC细胞穿过膜的细胞数明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。以上结果提示，ATG5作为癌基因，促进了HCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力。
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| 图 3 敲减ATG5基因其mRNA水平及蛋白水平表达的验证 A：在MHCC97-H中敲减ATG5基因后，mRNA水平ATG5的表达下调；B：敲减ATG5基因后，蛋白水平ATG5的表达下调。 |
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| 图 4 敲减ATG5基因对HCC细胞功能的影响 A、B：在HCCLM3（A）和MHCC97-H（B）HCC细胞中敲减ATG5基因，使用CCK8实验检测HCC细胞增殖能力的影响；C、D：在HCCLM3（C）和MHCC97-H（D）HCC细胞中敲减ATG5基因，使用划痕实验检测HCC细胞迁移的影响；E、F：在HCCLM3（E）和MHCC97-H（F）HCC细胞中敲减ATG5基因，使用Transwell实验检测HCC细胞侵袭能力的影响, Original magnification: ×200。 |
在MHCC97-H HCC细胞中，敲减ATG5基因进行有参转录组测序。p53信号通路GSEA图显示，在敲减ATG5基因后，p53信号通路基因出现富集（图 5A）。上调的基因为GADD45B、GADD45G、BBC3、CCNG1、CCNE2、TP53I3、APAF1等；下调的基因为SERPINE1、PMAIP1、BCL2L1、CCNG2、CCNE1等（图 5B）。进一步使用KEGG、Reactome、GO进行通路的富集分析，提示主要与细胞周期各个环节相关，其次与凋亡过程有关（图 5C）。此外，由于ATG5为自噬相关基因，分析自噬通路相关基因的变化结果（图 6A、6B）显示，ATG5下调后，基因PRAP1、GABARAPL1、ITPR1出现上调；基因CTSL、PIK3CA、ERN1、HIF1A出现下调。
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| 图 5 敲减ATG5基因对p53信号通路的影响 A：GESA图显示p53信号通路中差异基因富集；B：敲减ATG5基因后，分析有参测序结果中p53信号通路差异基因；C：KEGG、Reactome、GO通路的富集分析。 |
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| 图 6 敲减ATG5基因对自噬相关信号通路的影响 在MHCC97-H HCC细胞中，敲减ATG5基因后进行有参转录组测序。A：自噬信号通路差异基因的表达雷达图；B：自噬差异基因的表达热图。 |
为了验证ATG5对HCC生物学功能的影响，采用CCK-8、划痕、Transwell实验检测敲减ATG5基因后对细胞增殖、迁移、侵袭的变化。本研究结果提示，HCC组织中ATG5水平明显高于正常肝组织，在p53突变组的ATG5水平高于非突变组。在HCC细胞系的研究发现，与对照细胞株（L02）相比，ATG5在HCC细胞系中高表达，敲减ATG5基因后，可抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭功能。有参测序结果显示，敲减ATG5基因，可广泛地影响下游p53和自噬相关的信号通路。
在过去几十年，对自噬在恶性肿瘤中的研究较多。有研究[16]显示，自噬在胰腺癌中起到重要的作用，抑制自噬可以在治疗肿瘤中起到临床疗效，并不依赖p53的状态。ATG5基因的消失导致自噬和凋亡的异常，在胃肠道肿瘤病变中起到重要作用。但在黑素瘤的研究[17]中，下调ATG5的表达反而促进黑素瘤细胞的增殖。并非所有肿瘤中ATG5在癌组织中的表达均会增高，分析TCGA数据库结果显示，在膀胱尿路上皮癌、胰腺恶性腺瘤、大脑低级别胶质瘤、乳腺浸润性癌等肿瘤中，ATG5在癌和癌旁组织中的表达无差别。本研究的结果显示ATG5在HCC组织比正常肝组织高表达。自噬在肿瘤发病机制中及肿瘤进展中的作用仍有争议。一方面，自噬在肿瘤发展的早期阶段起着抑制作用，促进有缺陷的细胞器和未折叠的蛋白质的重新利用，防止氧化应激，并保持基因组的稳定性。另一方面，在已经形成的肿瘤中自噬也可以通过介导癌基因促进肿瘤的发展[18]，通过提供营养物质和能量，减少缺氧和氧化应激的压力，并促进血管生成，自噬也可促进肿瘤转移和侵袭[19]。同样本研究亦发现，在HCC细胞系中敲减ATG5基因后，抑制了HCC细胞的迁移和侵袭的能力。
肝脏是一个代谢器官，自噬在HCC发生发展中均起到重要的作用[20]。有研究[21]发现，在肝脏特异性ATG7或ATG5缺失小鼠模型中，自噬可能通过向微环境中提供额外的精氨酸的途径保护肿瘤细胞，这说明自噬在这种情况下部分补偿了营养的损失，因而促进细胞生长。但其在HCC发展中作用，目前的研究较少。本研究结果显示，在HCC中，ATG5在癌组织的水平明显高于正常肝组织，本课题组既往研究数据显示其高表达与患者生存预后负相关。进一步在HCC细胞系中验证了ATG5在HCC中的高表达，下调ATG5基因后会抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力，显示该基因促进HCC的发展，可成为预测和监测HCC预后分子标志物。阐明自噬依赖性发病的分子机制有助于发现新的HCC治疗方法。有证据[22]表明，抑制或诱导通过调节mTOR、AMPK和MAPK途径的自噬在肝脏中发挥着影响肿瘤发展重要作用。
近期研究[3]发现，自噬在HCC发展中通过几个关键的信号通路发挥着双重作用，这其中包括EGF、Wnt/β-catenin、p53和NF-κB途径。有研究提示自噬抑制p53功能，进一步促进肿瘤的进展，通过以下几方面的途径：自噬通过影响氧化应激进一步抑制p53的活化；自噬可以通过为DNA复制和修复提供底物，进一步抑制p53的激活；自噬通过维持代谢及内环境的稳定抑制AMPK的活化，AMPK可以激活p53[23]；伴侣介导的自噬可以降解p53[24]。本研究显示ATG5的高表达抑制p53通路相关基因，通过KEGG、Reactome、GO富集分析，显示与细胞周期各个环节的基因有关，考虑ATG5下调，激活p53信号通路相关基因，影响了细胞周期，进而调控HCC细胞的功能。自噬与p53信号通路存在相互影响，自噬可被p53激活或抑制，表明p53在调控HCC自噬中的双重作用。此外，在没有p53的情况下，自噬亦可被诱导，促进细胞死亡[24]。肿瘤细胞的p53突变状态及其参与调节自噬和凋亡的机制有待进一步研究。另外，分析自噬通路相关基因发现，ATG5基因敲减后，CTSL、PIK3CA、ERN1、HIF1A基因出现下调，既往研究[24]低氧可激活HIFs，进而在转录水平激活ATGs，维持在低氧的情况下细胞的存活。自噬通过影响氧化应激进一步抑制p53的活化。最新研究[25]显示消除内皮细胞ATG7后通过上调Stat1，进而抑制HIF1A基因表达，抑制缺血后血管的生成。本研究发现ATG5基因敲减后，基因HIF1A出现下调，在HCC中ATG5是否通过同样的机制影响HIF1A，尚需进一步探讨。
综上所述，本研究探讨ATG5在HCC组织高表达，发现临床分期越高的患者，ATG5水平越高，证实了ATG5下调可以抑制HCC细胞的功能，进一步有参测序结果显示其通过影响p53信号通路促进HCC发展。本研究仍存在不足之处，未在体内实验验证ATG5功能，将来需进一步动物实验验证ATG5的功能，并进一步探讨p53信号通路相关差异基因的具体功能及机制。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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