膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在中国新发人数和死亡人数分别达到91 893例和42 973例^[1]。超过25%膀胱癌患者在初次诊断时即为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）^[2]。新辅助化疗联合根治性膀胱切除术以及盆腔淋巴结清扫术是目前针对局限性MIBC的推荐治疗方案，然而患者术后5年生存率仍仅维持在50%以下^[3]。

近年来，以程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1，PD-1)单抗为代表的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）在晚期膀胱癌的治疗中取得了突破性的进展，但其单药治疗的客观反应率（ORR）仅维持在10%~30%，大部分患者仍无法从中获益^[4-5]。因此，探索PD-1单抗治疗疗效指标，构建晚期膀胱癌PD-1单抗疗效预测模型，筛选出对PD-1单抗治疗敏感的患者具有重要临床意义。

虽然已有许多指标如肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB), 肿瘤组织PD-L1表达和微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)等被尝试应用于预测PD-1/PD-L1单抗疗效^[5-7]，但这些指标均聚焦在肿瘤局部，对晚期膀胱癌患者，获取标本创伤大、难度高，且肿瘤局部状态不能代表患者整体免疫状态，难以持续动态监测。外周血免疫指标可反映机体整体免疫状态，以外周血免疫细胞作为PD-1单抗疗效预测指标具有获取便捷、创伤性小且满足动态持续检测需求^[8]。因此，如果能从外周血免疫细胞中筛选PD-1单抗疗效预测指标，可为晚期膀胱癌PD-1单抗疗效预测提供新的视角。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2017年8月至2021年4月复旦大学附属中山医院局部晚期或转移性膀胱癌患者86例。纳入标准：（1）年龄18周岁以上，80周岁以下；（2）细胞学证实为膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer, UBC）；（3）TNM分期为Ⅲ期或Ⅳ期；（4）ECOG评分为0或1分；（5）无心肺肝肾器官功能不全。排除标准：（1）患者合并其他肿瘤；（2）肿瘤脑转移；（3）免疫缺陷或接受慢性全身性类固醇治疗，或任何其他形式的免疫抑制治疗；（4）怀孕或哺乳。患者均使用帕博利珠单抗(Pembrolizumab，200 mg，q3w)或替雷利珠单抗（Tislelizumab，200 mg，q3w）。所有患者既往均在我院保存有组织病理标本。所有患者在首次使用PD-1单抗当天或前1 d均在我院检验科进行血液常规（XT-1800i全自动血液分析仪，Sysmex）和循环免疫细胞检测（BD FACS CantoⅡ流式细胞仪，Becton Dickinson）。通过查询病例检验数据，收集整理患者年龄、性别、外周血免疫细胞指标及肿瘤组织表达PD-1/PD-L1水平用于后续分析。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2017-129R），所有患者均知情且签署知情同意书。

1.2 分组方法

对于外周血免疫细胞指标，以中位数进行分组。肿瘤组织根据表达PD-1和PD-L1是否≥1%，分为阳性组（≥1%）和阴性组（＜1%）。肿瘤TNM分期参考更新后的第8版美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）膀胱癌TNM分期标准^[9]。

1.3 观察指标

主要观察指标为总体生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）和客观反应率(objective response rate, ORR)。OS定义为从患者接受PD-1单抗治疗到患者死亡或末次随访的时间。PFS定义为从患者接受PD-1单抗治疗到患者首次疾病进展或死亡时间。肿瘤治疗后的疗效评价依据实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumours, RECIST）1.1版^[10]。数据采集和随访中的质量控制措施：（1）所有患者临床信息，外周血数据及病理结果以电子数据形式直接传输给数据统计者，避免数据登记出错。（2）患者TNM分期由2位泌尿外科医生单独进行评估判断，确保患者TNM分期的准确性。（3）临床医生定期对患者进行电话随访，确保生存信息及时更新。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。通过χ²检验评估各指标与ORR之间的相关性。通过生存分析(Kaplan-Meier法)评估各指标对OS和PFS的影响。采用单因素和多因素Cox回归分析评估各项指标对患者生存的风险比及其95%CI。检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 一般资料分析

结果（表 1）显示：共纳入晚期UBC患者86例，其中≤65岁35例（40.7%），大于65岁51例（59.3%），女性28例（32.6%），男性58例（67.4%）。在组织病理标本中，28例（32.6%）患者肿瘤细胞PD-L1表达≥1%，58例（67.4%）患者肿瘤细胞PD-L1表达＜1%，44例（51.2%）患者间质细胞PD-L1表达≥1%，42例（48.8%）患者间质细胞PD-L1表达＜1%，45例（52.3%）患者肿瘤细胞PD-1表达≥1%，41例（47.7%）患者肿瘤细胞PD-1表达＜1%。

2.2 患者总体生存期的影响因素分析

生存分析结果（图 1）表明，患者TNM分期低（P=0.004，图 1A），外周血CD4⁺T细胞占总T细胞比例（CD4⁺T%）高（P=0.018，图 1B），自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞高（P=0.022，图 1C）以及B淋巴细胞高（P=0.014，图 1D），其OS显著延长。然而，肿瘤组织PD-1及PD-L1的表达水平对患者OS无明显影响。将上述有统计学差异的指标纳入多因素Cox回归分析，结果（表 2）表明患者TNM分期（P=0.02）、外周血CD4⁺T%（P=0.009）、NK细胞数量（P=0.009）以及B淋巴细胞数量（P=0.038）仍是影响患者OS的独立预后因子。

2.3 患者无进展生存期的影响因素分析

生存分析表明，患者TNM分期低（P＜0.001，图 2A），外周血NK细胞数量高（P=0.038，图 2B）以及B淋巴细胞高（P=0.005，图 2C），其PFS显著延长。同样，肿瘤组织PD-1及PD-L1的表达水平对患者PFS无明显影响。多因素Cox回归分析结果（表 2）表明，患者TNM分期（P＜0.001），外周血NK细胞数量（P=0.043）以及B淋巴细胞数量（P=0.027）仍是影响患者PFS的独立预后因子。

2.4 PD-1单抗治疗ORR的影响因素分析

对比各指标分组对患者对PD-1单抗治疗客观反应率的影响，结果显示，外周血淋巴细胞总数高（P＜0.001，图 3A）、CD4⁺T%高（P=0.041, 图 3B）以及B淋巴细胞高（P=0.011, 图 3C）的患者对PD-1单抗治疗有更高的客观反应率。

3 讨论

外周血淋巴细胞总数是反映机体免疫活性的指标之一，也是PD-1单抗治疗的靶细胞。作为机体适应性免疫的重要细胞类型，淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫中发挥核心作用。本研究提示，外周血淋巴细胞总数高的患者对PD-1单抗治疗客观反应率显著提升（P＜0.001），可作为预测患者PD-1单抗客观反应率的建议指标。

既往认为，PD-1单抗之所以能发挥抗肿瘤作用，是因为其抑制PD-1诱导的CD8⁺T细胞功能耗竭。因此CD8⁺T细胞在PD-1单抗治疗中的作用已经被广泛研究，但CD4⁺T细胞的重要性一直被忽视。事实上，CD4⁺T细胞可以通过支持CD8⁺T细胞的启动、迁移和存活来促进抗肿瘤免疫。不仅如此，CD4⁺T细胞在PD-1/PD-L1单抗治疗过程中发挥关键作用，并可作为预测PD-1/PD-L1单抗疗效的临床指标^[12-13]。因此，对于PD-1单抗的研究焦点不应该仅停留在既往的CD8⁺T细胞而忽视CD4⁺T细胞。本研究提示，外周血CD4⁺T%高的患者对PD-1单抗治疗客观反应率显著提升（P=0.041），其OS（P=0.018）也显著延长。最新研究^[14]显示，循环CD4⁺T细胞的免疫状态是决定PD-L1/PD-1阻断治疗NSCLC患者临床结局的关键因素。外周血基线较高的记忆表型CD27-CD28low/－CD4⁺T细胞比例（＞40%）可预测肺癌患者对PD-1单抗治疗的ORR^[15]。外周血CD62LlowCD4⁺T效应记忆细胞亚群数量较高的非小细胞肺癌患者对PD-1单抗的敏感性显著提升，而治疗后CD62LlowCD4⁺T细胞水平降低可导致获得性耐药^[16]。这表明，外周血CD4⁺T细胞记忆亚群可能是筛选PD-1单抗敏感患者的可靠标志物。

长期以来，肿瘤学家认为B细胞在抗肿瘤免疫反应中起负面作用^[17]。虽然，B细胞可以分泌白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)，并可以通过表达PD-1和PD-L1抑制抗肿瘤免疫反应^[18]。但另一方面，B细胞可作为抗原提呈细胞为效应细胞提呈抗原，分泌抗肿瘤细胞因子甚至直接分泌抗体对肿瘤细胞进行杀伤^[19]。有研究^[20]发现B细胞和三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure, TLS）能够促进肿瘤患者的生存率和免疫治疗灵敏度，并且可以作为预测ICIs治疗灵敏度的标志物，具有非常重要的临床意义。在ICIs治疗过程中抑制B细胞和滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)可使抗肿瘤免疫应答完全消失，其影响甚至比直接抑制CD8⁺T细胞更大^[21]。这提示在ICIs治疗过程中，B细胞并非肿瘤微环境中的旁观者，而是协调免疫应答的活跃参与者。本研究发现，外周血B淋巴细胞高的患者对PD-1单抗治疗客观反应率显著提升（P=0.011），其OS（P=0.014）和PFS（P=0.005）也显著延长。不仅如此，B细胞在导致ICIs治疗患者发生免疫相关不良事件过程中也可能发挥重要作用。在PD-1单抗联合CTLA-4单抗治疗过程中，循环B淋巴细胞减少，但CD21lowB细胞或浆母细胞升高的患者发生严重免疫治疗相关不良反应的风险明显上升^[22]。

NK细胞是机体免疫系统除CD8⁺T细胞外的抗肿瘤效应杀伤细胞。PD-1可表达于NK细胞表面，并介导NK细胞功能耗竭^[23]。因此NK细胞也可作为PD-1单抗的靶细胞。已有研究^[24]在多种肿瘤中均发现患者NK细胞表面PD-1表达明显上升。使用PD-1单抗可以逆转PD-1+NK细胞的功能耗竭状态^[25]。本研究发现，外周血NK细胞高的患者经PD-1单抗治疗后OS（P=0.022）和PFS（P=0.038）均显著延长，提示NK细胞在晚期UBC抗肿瘤免疫中扮演重要角色。

本研究提示外周血免疫细胞可作为晚期膀胱癌患者PD-1单抗治疗便捷的预测指标。患者TNM分期、外周血CD4⁺T%、NK细胞以及B淋巴细胞数量是影响患者预后的独立预测指标。外周血淋巴细胞总数、CD4⁺T%以及B淋巴细胞数量高的患者对PD-1单抗治疗客观反应率显著提升。但本研究存在一些不足之处，如其回顾性设计、单中心以及较少的样本数量。所以本研究所得结论仍需要后续进一步扩大样本量进行验证并探索其潜在机制。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。