2022, Vol. 29
随着肥胖和2型糖尿病人数的增加，非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty live disease, NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病，全球患病率约为25%[1]。在我国，NAFLD患病率已从2000年的23.8%增长到2018年的32.9%，成为我国发病率最高的肝脏疾病[2]。NAFLD谱由非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）、肝纤维化等构成。其中，NASH为较严重阶段，以小叶炎症、肝细胞脂肪变性、肝纤维化和肝细胞死亡为病理特征[3]。NASH在NAFLD人群中占比较高，且可能进展为肝硬化和肝细胞癌，且已成为肝移植和肝脏相关死亡的主要原因[4]，给全球带来巨大的卫生经济负担。
因此，深入了解NASH的机制、研发相应药物是临床迫切需求，然而目前尚无FDA批准的专门用于治疗NASH的药物。研发NASH药物的主要阻碍之一为缺少理想的动物模型。理想的动物模型应与人类疾病的生化、代谢、组织学、分子通路等多方面特征一致或接近。目前已经通过基因工程、饮食诱导、化学诱导等方法，开发了多种NASH动物模型，然而大多数模型并不能完整复现人类NASH[5]。因此，在科学研究和药物研发时，需要深入了解各模型的特点，选择合适的动物模型或模型组合，从而提高从动物试验到临床应用的可转化性。
本研究建立了高脂饮食（high-fat diet, HFD）、Amylin饮食，以及高脂-蛋氨酸胆碱缺乏饮食（high-fat methionine- and choline-deficient, HFMCD）诱导的NASH小鼠模型，并检测生化、代谢等指标，评估肝脏组织学变化，现报告如下。
1 材料和方法 1.1 实验材料实验用动物均为SPF级雄性C57BL/6小鼠，8~9周龄，体质量为22~25 g，购于上海实验动物公司。小鼠饲料购于Research Diets公司，分别为普通饲料(D11112201；65%碳水化合物，20%蛋白质，15%脂肪)，HFD饲料（D12492；60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白质），Amylin饲料（D09100301; 40%脂肪，22%果糖，10%蔗糖，2%胆固醇），以及HFMCD饲料（A06071301B; 60%脂肪，无蛋氨酸，无胆碱）。小鼠血清谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST），肝脏三酰甘油(triglycerides, TG)、肝脏羟脯氨酸检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。血糖检测采用Roche血糖仪及试纸。本研究通过复旦大学附属中山医院动物伦理审批（ZS334）。
1.2 动物饲养小鼠饲养于复旦大学上海医学院实验动物中心，屏障环境为(22±2)℃，相对湿度保持在40%~60%，给予12 h交替光照，小鼠自由进食、进水。根据饮食分为普通饮食（chow diet，CD）组、HFD组、Amylin组和HFMCD组，每组10只。其中，HFD、Amylin饲料喂养时长为24周，HFMCD饲料喂养时长为10周。喂养期间，通过在实验开始、换笼期间和实验结束时称量食物质量来监测食物消耗。
1.3 血清指标检测喂养结束时，取小鼠眼眶静脉血；血液静置于无内毒素试管2 h，在4℃、1 000×g条件下离心10 min后取上清液（血清）。血清ALT、AST，肝脏TG、肝脏羟脯氨酸检测均按照试剂盒说明书进行。小鼠禁食10 h后，尾尖采血，用血糖仪测定其空腹血糖值。胰岛素耐量试验（insulin tolerance test, ITT）：小鼠禁食4 h后所测血糖值记为0 min血糖，随后腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg），分别检测注射胰岛素后15、30、45、60、90、120 min时间点的血糖并用0 min血糖值矫正，绘制曲线。
1.4 肝组织石蜡切片及病理检查取血后，用颈椎脱位法处死小鼠，剥离肝脏。肝脏称质量后，取1 cm×1 cm×0.5 cm大小肝组织，浸于4%多聚甲醛固定24 h，随后用浓度递增乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后切片。肝指数=肝脏质量/小鼠体质量。
苏木精-伊红（H-E）染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用苏木精染色1 min，水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，1%氨水返蓝30 s，再次水洗，用伊红染液染色2 min，洗涤；常规用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。天狼星红染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用Weigert铁苏木精染液染色10 min，水洗，天狼星红染液滴染1 h，水洗；常规脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。
1.5 统计学处理用GraphPad Prism 9.0.0软件作图与进行统计学分析，数据以x±s表示，组间比较采用t检验，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 小鼠体质量和肝脏重量HFD组、Amylin组小鼠体质量显著高于CD组（P＜0.000 1）；HFMCD组体质量与CD组差异无统计学意义。HFD组、Amylin组、HFMCD小鼠肝脏质量均高于CD组（P＜0.01）。Amylin组、HFMCD组小鼠肝指数高于CD组（P＜0.01）；HFD组小鼠肝指数与CD组差异无统计学意义。Amylin组肝脏质量、肝指数较CD组的升高倍数明显更大（表 1）。
| 指标 | CD组 | HFD组 | Amylin组 | HFMCD组 |
| 体质量/g | 26.50±0.408 | 45.30±4.858*** | 45.78±2.369*** | 26.20±1.182 |
| 肝脏质量/g | 1.038±0.0585 | 2.081±0.3184** | 5.260±0.8364*** | 1.555±0.2308** |
| 肝指数/% | 3.910±0.199 | 4.607±0.663 | 11.440±1.281*** | 5.918±0.622** |
| CD：普通饮食；HFD：高脂饮食；Amylin：Amylin饮食；HFMCD：高脂-蛋氨酸胆碱缺乏饮食。**P＜0.01、***P＜0.000 1与CD组相比。 | ||||
饮食诱导组小鼠的血清ALT水平均高于CD组（P＜0.05），其中HFD组升高程度较小；Amylin组和HFMCD组小鼠血清AST高于CD组（P＜0.01），HFD组与CD组AST差异无统计学意义。饮食诱导组肝脏TG含量均高于CD组（P＜0.01），其中Amylin组升高程度最大。Amylin组与HFMCD组肝脏羟脯氨酸水平高于CD组（P＜0.01），HFD组和CD组肝脏羟脯氨酸水平差异无统计学意义（表 2）。
| 指标 | CD组 | HFD组 | Amylin组 | HFMCD组 |
| ALT/(U·L－1) | 13.96±10.82 | 54.38±25.15* | 421.52±70.87*** | 456.04±166.63** |
| AST/(U·L－1) | 56.70±13.94 | 68.71±21.92 | 310.44±41.85*** | 255.76±100.22** |
| 肝脏三酰甘油/(mg·g－1） | 33.70±7.85 | 61.39±12.46** | 132.96±51.62** | 92.22±19.50** |
| 肝脏羟脯氨酸/(mg·g－1） | 0.0725±0.0206 | 0.0914±0.0285 | 0.3589±0.0964** | 0.2871±0.0659** |
| 空腹血糖/(mg·L－1） | 1002.50±56.79 | 1778.57±267.30** | 1734.4±132.68*** | 733.33±148.14** |
| CD：普通饮食；HFD：高脂饮食；Amylin：Amylin饮食；HFMCD：高脂-蛋氨酸胆碱缺乏饮食；ALT：谷氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.000 1与CD组相比。 | ||||
HFD组和Amylin组小鼠空腹血糖水平升高，HFMCD组小鼠空腹血糖水平降低（P＜0.01，表 2）。ITT试验中，Amylin组各时间点血糖水平高于CD组（P＜0.001），且升高最明显；HFMCD组各时间点血糖水平与CD组差异无统计学意义（图 1）。
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| 图 1 各组小鼠的ITT测试结果 *P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.000 1与CD组相比。 |
H-E染色（图 2A）显示：CD组肝脏组织结构完整，肝小叶清晰；饮食诱导组均出现肝脂肪变性及肝小叶炎性浸润，脂肪变性严重程度依次为Amylin组、HFMCD组、HFD组。天狼星红染色（图 2B）显示：饮食诱导组均有胶原纤维形成，其中HFMCD组、Amylin组胶原纤维形成较多，说明肝纤维化严重。
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| 图 2 各组小鼠肝脏切片的H-E染色（A）及天狼星红染色（B） |
NASH已成为全球性的健康问题，而动物模型无法很好模拟人类疾病阻碍了相关药物的研发。因此，需要正确选择或组合动物模型，从而更准确地预测药物在人体内的反应[6]。将不同模型相结合以利用各自的优势是NASH研究的常用方法，例如db/db、ob/ob基因突变小鼠常用于研究与早期NAFLD相关的代谢综合征，蛋氨酸胆碱缺乏（methionine- and choline-deficient, MCD）模型常用于研究短时间内NASH肝脏的晚期纤维化[7]。本研究建立了3种饮食诱导的NASH小鼠模型，比较NASH相关指标，旨在评估各模型的临床可转化性。
HFD被广泛用于诱导实验动物发生NASH。HFD模型与人类NASH多种表型相似，包括肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等[8]。然而，该模型表型受动物品系、饮食中脂肪的含量、各类脂肪的组成以及诱导持续时间等影响[9]。而且，HFD诱导的肝损伤常不严重[10]。本研究显示，与CD组相比，HFD组体质量升高，并出现明显的胰岛素抵抗，但是肝细胞受损指标ALT、肝纤维化指标羟脯氨酸升高不明显，肝组织染色也显示小鼠NASH的特征性病理表现不如其他饮食诱导模型严重。
Amylin饮食能可靠诱导类似人类疾病生化、代谢和组织学等特征的动物模型[11]。本研究中，Amylin组小鼠体质量、肝脏质量、胰岛素敏感性下降及肝脏病变程度均高于CD组，NASH表型与人类类似。因此，Amylin饮食诱导的NASH具有较高的临床可转化性。然而，近期FDA禁止将反式脂肪作为食品添加剂。目前已研发出可替代Amylin饮食的Gubra Amylin NASH（GAN）饮食，GAN与Amylin饮食具有相同的能量比例和类似的诱导效果[12]。
HFMCD是近期新建立的NASH诱导饮食，为HFD和MCD两种饮食结构的结合[13]。MCD已被广泛用于NASH研究，能快速诱导多个严重的NASH表型，但不能诱导胰岛素抵抗[14]。既往研究[15]评估了HFMCD的诱导效果，发现其能迅速诱导肝损伤、脂肪累积、炎症反应和纤维化，不导致显著的体质量改变，但使肝指数增加。然而，HFMCD同样不能导致胰岛素抵抗[16]。本研究得出相似结果。
目前，国内外鲜见研究对上述3种饮食模型进行比较。本研究结果说明，3种饮食诱导的NASH小鼠模型各有优劣势：HFD能有效诱导肥胖、胰岛素抵抗等NASH患者常见的代谢紊乱，但难以导致严重的肝脏病变；Amylin饮食不仅能引起显著的肥胖和胰岛素抵抗，其诱导的肝脏病变也较严重；HFMCD相较于前2种模型，能更迅速引起明显的NASH特征，但不能导致肥胖和胰岛素抵抗。
综上所述，本研究为NASH机制研究和药物研发中临床前模型的选择提供了一定参考。未来可通过分析各动物模型中人类NASH中的关键信号通路（如炎症信号、凋亡信号）的变化，并从转录组、代谢组学角度评价动物模型，以进一步改进动物模型，进而更好地服务于临床。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
| [1] |
YOUNOSSI Z, ANSTEE Q M, MARIETTI M, et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2018, 15(1): 11-20.
[DOI]
|
| [2] |
ZHOU J H, ZHOU F, WANG W X, et al. Epidemiological features of NAFLD from 1999 to 2018 in China[J]. Hepatology, 2020, 71(5): 1851-1864.
[DOI]
|
| [3] |
YOUNOSSI Z M, KOENIG A B, ABDELATIF D, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes[J]. Hepatology, 2016, 64(1): 73-84.
[DOI]
|
| [4] |
YOUNOSSI Z M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective[J]. J Hepatol, 2019, 70(3): 531-544.
[DOI]
|
| [5] |
SANTHEKADUR P K, KUMAR D P, SANYAL A J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2018, 68(2): 230-237.
[DOI]
|
| [6] |
HUNDERTMARK J, TACKE F. How effective are nonalcoholic fatty liver disease models for drug discovery?[J]. Expert Opin Drug Discov, 2020, 15(11): 1237-1240.
[DOI]
|
| [7] |
RINELLA M E, GREEN R M. The methionine-choline deficient dietary model of steatohepatitis does not exhibit insulin resistance[J]. J Hepatol, 2004, 40(1): 47-51.
[DOI]
|
| [8] |
NAKAMURA A, TERAUCHI Y. Lessons from mouse models of high-fat diet-induced NAFLD[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(11): 21240-21257.
[DOI]
|
| [9] |
KANURI G, BERGHEIM I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(6): 11963-11980.
[DOI]
|
| [10] |
OMAGARI K, KATO S, TSUNEYAMA K, et al. Effects of a long-term high-fat diet and switching from a high-fat to low-fat, standard diet on hepatic fat accumulation in Sprague-Dawley rats[J]. Dig Dis Sci, 2008, 53(12): 3206-3212.
[DOI]
|
| [11] |
TREVASKIS J L, GRIFFIN P S, WITTMER C, et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 302(8): G762-G772.
[DOI]
|
| [12] |
BOLAND M L, ORÓ D, TØLBØL K S, et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source[J]. World J Gastroenterol, 2019, 25(33): 4904-4920.
[DOI]
|
| [13] |
MATSUMOTO M, HADA N, SAKAMAKI Y, et al. An improved mouse model that rapidly develops fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis[J]. Int J Exp Pathol, 2013, 94(2): 93-103.
[DOI]
|
| [14] |
ITAGAKI H, SHIMIZU K, MORIKAWA S, et al. Morphological and functional characterization of non-alcoholic fatty liver disease induced by a methionine-choline-deficient diet in C57BL/6 mice[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6(12): 2683-2696.
|
| [15] |
LEE S, KWAK J H, KIM S H, et al. Comparative study of liver injury induced by high-fat methionine- and choline-deficient diet in ICR mice originating from three different sources[J]. Lab Anim Res, 2019, 35: 15.
[DOI]
|
| [16] |
WIDJAJA A A, SINGH B K, ADAMI E, et al. Inhibiting interleukin 11 signaling reduces hepatocyte death and liver fibrosis, inflammation, and steatosis in mouse models of nonalcoholic steatohepatitis[J]. Gastroenterology, 2019, 157(3): 777-792, e14.
[DOI]
|
