2022, Vol. 29
2. 复旦大学生命科学学院，上海 200000
2. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200000, China
体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是治疗不孕症的有效手段，而胚胎体外培养是IVF-ET的关键环节。胚胎培养箱模拟体内环境，保持pH值、温度、气体含量、渗透压和湿度与体内一致。尽管培养箱中覆盖油的培养皿消除了pH值和温度的变化，但难以克服培养基渗透压变化的影响。Yumoto等[1]发现，干式培养箱内培养基渗透压不稳定；Boumerdassi等研究[2]发现，无论培养皿中矿物油含量如何，干式培养箱中微滴的渗透压在培养3 d后都明显升高。此外，Fawzy等[3]的前瞻性随机对照研究表明，干式培养与湿式培养相比显著降低了着床率及临床妊娠率。
时差成像（time-lapse，TL）技术是近年来发展的一种新型胚胎培养与胚胎实时观察技术，其有效性和安全性备受关注[4-6]。与传统培养时需频繁拿取胚胎至箱外观察不同，TL能为胚胎提供更稳定的培养环境，不用开箱即可动态观察受精及胚胎发育情况[5]。然而，应用干式TL培养箱培养时，随着培养时间的延长，渗透压也随之发生变化[7]。TL培养渗透压变化对胚胎发育的影响须进一步确定。因此，本研究以传统湿式培养为对照，结合培养5 d后微滴渗透压变化，分析TL培养箱中不同年龄女性胚胎发育的效果。
1 资料与方法 1.1 一般资料回顾性选择2020年7月至2021年12月在本院第1次行IVF-ET治疗的2 390对夫妻，胚胎培养共2 390个周期，其中TL组640对夫妻640个周期，对照组1 750对夫妻1 750个周期。两组女方年龄、不孕类型、不孕因素、女方体质量指数（BMI）、基础卵泡刺激素（FSH）水平、基础黄体生成素（LH）水平、促性腺激素（Gn）用量、受精方式和平均获卵数等差异均无统计学意义（表 1）。
| 项目 | TL组（n=640） | 对照组（n=1 750） | P值 |
| 女方年龄/岁 | 35.1±5.3 | 35.3±5.7 | 0.586 |
| 不孕类型n(%) | 0.353 | ||
| 原发 | 298(46.56) | 832(47.54) | |
| 继发 | 342(53.43) | 918(52.45) | |
| 不孕原因n(%) | |||
| 女方 | 534(83.43) | 1 466(83.77) | 0.851 |
| 男方 | 63(9.84) | 142(8.11) | 0.187 |
| 双方 | 31(4.84) | 103(5.89) | 0.367 |
| 不明原因 | 12(1.88) | 39(2.23) | 0.749 |
| 女方BMI/(kg·m－2) | 21.79±2.82 | 21.63±3.10 | 0.449 |
| 基础FSH/(U·L－1) | 6.52±2.88 | 6.31±264 | 0.362 |
| 基础LH/(U·L－1) | 3.88±3.04 | 3.96±2.67 | 0.162 |
| 受精方式 | 0.261 | ||
| IVF | 493(77.03) | 1 307(74.68) | |
| ICSI | 147(22.96) | 443(25.31) | |
| Gn | 0.465 | ||
| 总量/U | 1 530.7±837.7 | 1 332.2±938.8 | |
| 应用天数 | 8.1±2.5 | 7.5±3.1 | 0.258 |
| 平均获卵数/枚 | 9.6±6.1 | 8.8±6.8 | 0.107 |
两组分别应用ASTEC APM-50D湿式三气培养箱和ESCO Miri-TL干式培养箱，采用一步法胚胎培养液（vitrolife GTL）培养。采卵前1 d配液充分覆油并过夜平衡。渗透压检测：取过夜平衡后的培养液50 µL，等分后放入渗透压计样品管中，立即用德国GONOTEC冰点渗透压仪OSMOMAT 030进行渗透压测试，每份样品重复测试3次以确保测值准确性。对于每组测试样品，每次从培养箱中取出1个培养皿来测量渗透压，其他留在培养箱中。同一天要测量的培养皿放于培养箱同一腔室。测试前每天校准渗透压计，测试时间点保持一致。
1.3 胚胎获取所有研究对象均采用拮抗剂方案，于月经后第2天或第3天，给予重组人促卵泡激素（rhFSH，G-F，默克）75~300 U/d促排卵，根据患者年龄、窦卵泡数（AFC）、抗缪勒管激素（AMH）、BMI确定启动剂量。当主导卵泡直径达14 mm或LH＞10 U/L时加用促性腺激素释放激素拮抗剂GnRH-ant至注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）日。扳机后36~38 h取卵。根据患者情况，于获卵后2~4 h行常规体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射受精（ICSI）；授精后16~18 h检查受精情况，并继续培养至第5天或第6天，根据临床情况行新鲜胚胎移植或胚胎冷冻保存。
1.4 胚胎质量评估常规湿式培养第2天或第3天评估卵裂期胚胎情况，第5天或第6天评估胚胎囊胚发育情况。受精后第3天参考Brainden标准对卵裂期胚胎质量进行评分，正常受精7~9个细胞、评分1~2级的胚胎为优质胚胎；≥6个细胞、评分3级及以上的胚胎为有效胚胎[8]。受精后第5~6天参考Gardner等[9]的方法对囊胚质量进行评分，优于3BB定义为优质囊胚。TL培养除卵裂期和囊胚期常规观察外，每5 min记录1次胚胎图像，生成动态胚胎发育视频[5]。
比较两组正常受精率、正常卵裂率、有效胚胎率、优质胚胎率、囊胚形成率和优质囊胚率等。正常受精率＝正常受精数/获卵数×100%；正常卵裂率＝正常卵裂数/总受精数×100%；有效胚胎率＝有效胚胎数/正常卵裂数×100%；优质胚胎率＝优质胚胎数/正常卵裂数×100%；囊胚形成率＝囊胚形成数/培养囊胚数×100%；优质囊胚率＝优质囊胚数/培养囊胚数×100%。
1.5 统计学处理采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以n(%)表示，组间比较采用χ2检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 渗透压测量结果结果（图 1）显示：两组微滴渗透压在培养期间均增加。培养第3天，TL组微滴的渗透压增加约14.6 mOsm/kg（5.4%），对照组增加约5.0 mOsm/kg（1.8%，P＝0.222）；培养第5天，TL组渗透压3次测量平均值约为300 mOsm/kg，达最高值，增加28.6 mOsm/kg（10.6%），对照组增加约12.0 mOsm/kg（4.4%，P＝0.052）。
|
| 图 1 两组渗透压变化 |
结果（表 2）显示：20~29岁：TL组有效胚胎率、优质胚胎率均显著高于对照组（P＜0.01）；30~34岁：TL组优质胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率均高于对照组（P＜0.05）；35~39岁：TL组各指标与对照组差异无统计学意义；≥40岁：TL组优质胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率均低于对照组（P＜0.05）。
| % | |||||||||||||||||||||||||||||
| 年龄 | 正常受精率 | 正常卵裂率 | 有效胚胎率 | 优质胚胎率 | 囊胚形成率 | 优质囊胚率 | |||||||||||||||||||||||
| 20~29岁 | |||||||||||||||||||||||||||||
| TL组（n＝99） | 81.37(734/902) | 96.87(711/734) | 75.39(536/711)** | 49.79(354/711)** | 55.43(296/534) | 33.33(178/534) | |||||||||||||||||||||||
| 对照组（n＝265） | 82.35(2 034/2 470) | 96.51(1 963/2 034) | 70.15(1 377/1 963) | 41.98(824/1 963) | 56.62(633/1 118) | 32.47(363/1 118) | |||||||||||||||||||||||
| 30~34岁 | |||||||||||||||||||||||||||||
| TL组（n＝198） | 83.05(1 298/1 563) | 97.00(1 259/1 298) | 74.66(940/1 259) | 46.70(588/1 259)** | 57.14(552/966)* | 35.82(346/966)* | |||||||||||||||||||||||
| 对照组（n＝580） | 82.64(3 913/4 735) | 98.21(3 843/3 913) | 72.76(2 796/3 843) | 41.43(1 592/3 843) | 52.74(1 231/2 334) | 32.26(753/2 334) | |||||||||||||||||||||||
| 35~39岁 | |||||||||||||||||||||||||||||
| TL组（n＝217） | 81.53(1 068/1 310) | 97.75(1 044/1 068) | 71.93(751/1 044) | 45.50(475/1 044) | 50.80(381/750) | 31.73(238/750) | |||||||||||||||||||||||
| 对照组（n＝480） | 80.97(2 046/2 527) | 98.14(2 008/2 046) | 72.71(1 460/2 008) | 44.12(886/2 008) | 51.68(553/1 070) | 28.32(303/1 070) | |||||||||||||||||||||||
| ≥40岁 | |||||||||||||||||||||||||||||
| TL组（n＝126） | 82.36(467/567) | 97.22(454/467) | 73.79(335/454) | 44.05(200/454)* | 34.9(104/298)** | 16.11(48/298)* | |||||||||||||||||||||||
| 对照组（n＝425） | 82.78(1 125/1 359) | 98.22(1 105/1 125) | 76.83(849/1 105) | 48.96(541/1 105) | 46.24(240/519) | 21.77(113/519) | |||||||||||||||||||||||
| 总计（n＝2 390） | |||||||||||||||||||||||||||||
| TL组（n＝640） | 82.15(3 567/4 342) | 97.22(3 468/3 567) | 73.88(2 562/3 468) | 46.63(1 617/3 468)** | 52.32(1 333/2 548) | 31.79(810/2 548) | |||||||||||||||||||||||
| 对照组（n＝1 750） | 82.21(9 118/11 091) | 97.82(8 919/9 118) | 72.68(6 482/8 919) | 43.09(3 843/8 919) | 52.71(2 657/5 041) | 30.39(1 532/5 041) | |||||||||||||||||||||||
| *P＜0.05、**P＜0.01同年龄段两组间相比。 | |||||||||||||||||||||||||||||
一步法培养基结合台式TL培养近年来已在辅助生殖领域得到较多应用，其优点为不需要开箱即可动态观察胚胎发育，为胚胎选择提供更多依据。但是，其培养效果目前存在争议。2012年，Kirkegaard等[10]将TL培养和常规湿式培养效果进行比较，以第2天4个细胞、第3天7~8个细胞、第5天囊胚形成率和种植率为评估指标，结果显示两组间差异无统计学意义。Sciorio等[11]发现TL培养第2天和第3天的优质胚胎率高于常规培养方法，而第5天或第6天的优质囊胚率与常规培养方法差异无统计学意义。2018年Barberet等[12]的随机对照研究显示，TL培养第3天优质胚胎率高于常规培养。
目前这2种培养方式在不同女方年龄组的应用效果鲜见报道。本研究发现，在女方低龄（20~34岁）组，TL组胚胎发育情况优于常规培养；在高龄组（≥40岁），TL组优质胚胎率、囊胚形成率和优质囊胚率则显著降低；年龄34~39岁，两组间胚胎发育情况差异无统计学意义。随着培养时间的延长，TL组微滴渗透压明显增加，第5天渗透压接近培养基最高阈值，提示TL培养箱中微滴水分随培养时间延长逐渐蒸发，因此渗透压逐渐增加，虽然与对照组差异无统计学意义，但仍有参考价值。文献[13]表明，渗透压增加至300 mOsm/kg时，小鼠胚胎发育潜能急剧下降。虽然该渗透压阈值在人类尚未明确，但人与鼠生殖道生理特性相似，提示人类与小鼠体外渗透压要求可能相当[14]。本研究中，渗透压改变并没有影响年轻女性胚胎的发育，可能与年轻女性卵子质量佳，能对抗渗透压改变有关，但对于高龄（≥40岁）患者，胚胎发育潜能本身较差，对环境特别是渗透压的改变更为敏感，渗透压的增加显著抑制了胚胎的发育潜能, 降低了囊胚形成率及优质囊胚率。
综上所述，本研究显示，干式TL结合一步法培养基较传统湿式培养在年轻女性体外胚胎培养中更有优势，但是随着培养时间的延长，渗透压逐渐升高，对高龄女性胚胎发育呈现不利影响，提示高龄女性胚胎培养可能更适用传统湿式方法。如何充分利用TL培养优点，又能克服长时间培养后渗透压的改变可能须获得辅助生殖领域更多的关注，开发可加水的湿式TL培养箱可能有帮助。此外，本研究为单中心回顾性研究，未来需要多中心更大样本RCT研究验证TL培养对胚胎发育潜能的影响。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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