2022, Vol. 29
2. 复旦大学附属中山医院中西医结合科，上海 200032;
3. 复旦大学中西医结合研究院内科研究所，上海 200032
2. Department of Integrative Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. Institute of Internal Medicine, Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, Shanghai 200032, China
罗布麻属夹竹桃科植物[1]，是药食同源植物，具有广泛的药用和保健功效。临床研究发现罗布麻叶浸膏片可改善夜尿等部分衰老症状，对降低血清过氧化脂质、升高发锌、提高男性血浆睾丸酮可能具有一定作用[2]；可提高老年人自然杀伤细胞活性及红细胞超氧化物歧化酶含量，改善甲皱微循环的血流状态，有一定延缓衰老的作用[3]。在动物模型中，罗布麻提取物可延长果蝇寿命，促进家兔及大鼠的免疫功能，降低大鼠血清过氧化脂质水平[4]。鉴于罗布麻抗衰老的多成分、多靶点的药理学特征，本研究拟借助网络药理学结合动物模型进一步探讨罗布麻的抗衰老作用和机制。
1 材料与方法 1.1 网络药理学研究 1.1.1 罗布麻成分收集和筛选采用数据库TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）与文献检索相结合的方法收集罗布麻的主要活性成分。根据药物动力学参数对其进行筛选，该参数为药物口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%以及类药性（drug likeness, DL）≥0.18。
1.1.2 罗布麻成分靶点预测采用中药成分靶点数据库TCMSP、TCMID结合文献检索的方法收集和筛选罗布麻的成分靶点。
1.1.3 衰老的疾病靶点预测在疾病靶点数据库OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（http://www.genecards.org/），以关键词“aging”获得衰老的相关基因。
1.1.4 靶点的蛋白互作网络利用Venny 2.1获得罗布麻成分与疾病靶点的交集，随后导入STRING（http://stringdb.org/），进行蛋白互作分析，结果以TSV格式导入Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）软件进行网络拓扑结构分析，构建蛋白-蛋白相互作用网络。
1.1.5 成分-靶点-疾病网络构建利用Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）将上述所得结果网络拓扑结构分析，构建成分-靶点-疾病网络。
1.1.6 靶点功能和通路富集分析利用基因本体（gene ontology, GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）数据库，以及R3.6.3软件运行的Bioconductor生物信息软件包（http://www.bioconductor.org/）对靶点功能和通路进行富集分析。
1.2 动物实验 1.2.1 实验动物C57-BL/6小鼠，雄性，8周龄，体质量18~20 g，由复旦大学附属中山医院动物实验中心提供。动物使用通过复旦大学附属中山医院动物伦理委员会审核[动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005；动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0006]。
1.2.2 药物和试剂罗布麻提取物（日本常盘生药研究所）、D-半乳糖（美国Sigma公司）、苏木精-伊红(H-E)染液（江苏凯基生物技术股份有限公司）、兔抗鼠p53一抗(江苏Immunoway公司）、兔抗鼠GAPDH（江苏凯基生物技术股份有限公司）、FITC标记羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch公司）、羊抗兔IgG-HRP（江苏凯基生物技术股份有限公司）。
1.2.3 实验仪器电泳仪（美国Bio-Rad公司）、Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司）、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）、电热扶风干燥箱（上海圣欣科学仪器有限公司）、BX43荧光显微镜（日本Olympus公司）。
1.2.4 动物分组与给药将小鼠随机分为对照组、模型组、罗布麻组，每组6只。参考既往研究[5]，模型组和罗布麻组颈背部皮下注射5% D-半乳糖（100 mg•kg－1•d－1），对照组同部位注射等体积生理盐水。参考既往研究[6]罗布麻给药剂量，罗布麻组在注射D-半乳糖的同时，给予100 mg•kg－1•d－1的罗布麻提取物灌胃，模型组每天等体积生理盐水灌胃，连续造模和给药8周。
1.2.5 组织取材造模8周后颈椎脱臼处死小鼠，暴露胸腹部，常规消毒，打开腹腔，取小鼠肝脏组织，液氮速冻后转入－80 ℃保存，用于后续H-E染色、免疫荧光染色和Western印迹检测。
1.2.6 H-E染色取肝脏组织，4%多聚甲醛固定，脱水、包埋，制备4 μm石蜡切片，随机选取肝脏切片（n=3），经梯度二甲苯脱蜡、梯队乙醇复水，行H-E染色，脱水、透明、封片。光镜下观察肝脏组织大体病理改变。
1.2.7 免疫荧光染色取肝脏组织，制备4 μm冰冻切片，随机选取肝脏切片（n=3），1%丙酮固定，经3% H2O2-甲醇溶液灭活、1% BSA封闭后，p53一抗（1∶100）37℃孵育2 h，FITC标记荧光二抗（1∶200）37℃孵育2 h，DAPI复染，荧光显微镜下观察p53的表达情况。
1.2.8 Western印迹法取肝脏组织，提取总蛋白，样品经过蛋白质含量测定后，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，BSA封闭，采用1∶1 000稀释的一抗4℃孵育过夜，1∶1 000稀释的二抗37℃孵育1 h，增强化学发光法反应，曝光，显影，拍照，光密度定量分析。
1.3 统计学处理实验所得数据均采用SPSS 13.0统计软件包进行分析，结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 网络药理学预测 2.1.1 罗布麻活性成分筛选及其靶点经数据库查找出56个活性成分，筛选并去重后获得谷甾醇（sitosterol）、花青素B1（procyanidin B1）、山奈酚（kaempferol）、(+)-儿茶素[(+)-catechin]、木犀草素（luteolin）、表儿茶素（ent-Epicatechin）6个活性成分，及罗布麻宁（apocynin）、金丝桃苷（hyperoside）、芸香苷（rutin）3个活性成分，共计9个活性成分（表 1）。利用数据库查询上述活性成分的靶点信息，筛选并去重后得到122个作用靶点。
| TCMSP编号 | 化合物名称 | OB/% | DL |
| MOL000359 | 谷甾醇 | 36.91 | 0.75 |
| MOL000004 | 花青素B1 | 67.87 | 0.66 |
| MOL000422 | 山奈酚 | 41.88 | 0.24 |
| MOL000492 | (+)-儿茶素 | 54.83 | 0.24 |
| MOL000006 | 木犀草素 | 36.16 | 0.25 |
| MOL000073 | 表儿茶素 | 48.96 | 0.24 |
| MOL002786 | 罗布麻宁 | 31.71 | 0.04 |
| MOL004368 | 金丝桃苷 | 6.94 | 0.77 |
| MOL000415 | 芸香苷 | 3.20 | 0.68 |
通过GeneCards数据库、DisGeNET数据库、TTD数据库、OMIM数据库筛选出共计2 183个与衰老相关靶点，采用Venny 2.1软件与罗布麻活性成分靶点交集，得到85个共同靶点（图 1）。
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| 图 1 罗布麻活性成分靶点与衰老靶点交集Venny图 |
运用Cytoscape 3.8.1软件构建成分-靶点-疾病网络（图 2），共132个节点和276条边。山奈酚、木犀草素以及芸香苷与靶点的联系最为广泛。
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| 图 2 罗布麻成分-靶点-疾病网络 紫色三角形节点：罗布麻活性成分；蓝色椭圆节点：潜在靶点；棕色正方形节点：疾病；每条边：化合物和靶点之间的相互作用关系。 |
根据蛋白互作网络（图 3A），筛选出degree值排名前30位的靶点，其中p53、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）等可能是抗衰老的主要潜在靶点（图 3B）。
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| 图 3 潜在靶点的蛋白-蛋白互作网络 A：蛋白互作网络节点图，大小和颜色反映节点degree值，节点越大、颜色越深，degree值越大，表示该靶点与其他靶点之间的相互作用越广泛；B：蛋白互作网络关键靶点的degree值。 |
结果（图 4）显示：通过GO富集分析，筛选出85个靶点116个分子功能条目（P＜0.05），主要为磷酸酶结合、泛素样-蛋白连接酶结合、蛋白磷酸酶结合、氧化还原酶活性、细胞因子受体结合、血红素结合、四吡咯结合、泛素蛋白连接酶结合以及细胞因子活性等。
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| 图 4 GO功能富集分析气泡图 |
结果（图 5）显示：通过KEGG通路富集分析筛选出85个靶点163条信号通路，主要与磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphoinositide3-kinase-Akt, PI3K-Akt）信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product）信号通路、内分泌抵抗、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路等。
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| 图 5 KEGG通路富集分析气泡图 |
与对照组小鼠比较，模型组小鼠出现精神萎靡，倦怠嗜睡，喜扎堆，进食减少，毛色枯槁无光泽、易脱落，皮肤弹性差等衰老体征，罗布麻组小鼠上述情况改善。
2.2.2 罗布麻对衰老小鼠肝脏组织的影响对照组小鼠肝小叶、汇管区等结构基本完整，肝细胞形态基本正常，无变性和坏死；模型组小鼠肝组织发生肝细胞排列紊乱，肝细胞脂肪变性、局灶坏死、验证细胞浸润等退行性改变；罗布麻组小鼠肝组织肝细胞排列稍紊乱，肝细胞脂肪变性、局灶坏死、验证细胞浸润等退行性改变较模型组小鼠减轻（图 6）。
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| 图 6 小鼠肝脏组织H-E染色 A：对照组；B：罗布麻组；C：模型组。Original magnification：×400。 |
采用Western印迹法检测罗布麻对关键靶点p53表达的影响（图 7A、7B）：与对照组比较，模型组小鼠p53的表达水平显著上调（P＜0.01）；罗布麻组小鼠p53的表达水平上调，但低于模型组（P＜0.05）。采用免疫荧光检测小鼠p53的表达（图 7C）：罗布麻组p53表达较模型组减弱。
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| 图 7 小鼠肝脏p53表达分析 A：Western印迹法检测小鼠肝脏p53表达；B：小鼠肝脏p53表达定量分析（n=3），*P＜0.05、**P＜0.01与对照组比较；C：免疫荧光检测小鼠肝脏p53表达，绿色荧光为p53，蓝色荧光为细胞核，Original magnification：×400。 |
本研究通过文献和网络数据库筛选出金丝桃苷、木犀草素、芸香苷、儿茶素、罗布麻宁等关键活性成分。在衰老大鼠模型中，金丝桃苷通过抑制自噬衰老进程中的肾脏结构老化、损伤，缓解其功能衰退[7]。芸香苷可上调衰老相关基因叉头框蛋白O（forkhead box protein O，FoxO）及抗氧化基因锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）的表达，进而提高高脂饮食饲养的果蝇对冷热休克、饥饿应激的抵抗能力，并延长其寿命[8-10]；木犀草素可上调sirtuin 1和p53的表达，进而减轻H2O2诱导的氧化应激性细胞衰老[11]；儿茶素可提高机体的抗氧化能力，促进大脑单胺能神经递质的分泌，改善衰老进程中的脑功能和日常生活活动能力[12]；罗布麻宁是天然的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶（NADH）氧化酶抑制剂，可通过调控一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达，调控衰老进程中血管结构老化和功能衰退[13-15]。
通过数据库检索筛选出85个作用靶点，其中核心靶点为p53、AKT1、IL-6、INS。p53是重要的转录因子，在细胞应激反应、细胞增殖与凋亡、DNA修复、衰老细胞微环境调控过程中发挥重要作用[16]。在线虫和小鼠衰老模型中发现，p53通过负向调控细胞自噬延缓衰老[17]。AKT在细胞存活和凋亡中起重要作用，活化的AKT通过磷酸化多种激酶和转录因子等调节细胞功能，包括p21、p27、Foxo等衰老相关分子[18]。胰岛素抵抗是衰老在代谢上的重要特点之一[19]，并进一步介导衰老进程中的炎症环境改变[20]。衰老状态下循环炎症标志物处于高水平，其中超过800个基因转录与IL-6有关[21-22]。
通过KEGG通路富集分析筛选出PI3K-AKT、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、内分泌抵抗、IL-17、TNF-α等信号转导通路，其在衰老过程中调控细胞存活和凋亡、代谢、炎症反应等关键生物学过程。
3.2 罗布麻的抗衰老作用和靶点的实验验证在以往罗布麻抗衰老研究[2-4, 6]基础上，本研究采用D-半乳糖皮下注射构建衰老小鼠模型，观察到罗布麻可改善衰老小鼠的一般衰老症状和体征，减轻衰老导致的肝脏组织病理学改变，抑制衰老进程中肝脏组织p53表达的上调。p53作为一种转录因子发挥作用，通过结合启动子区域来上调或下调特定靶基因的表达，通过结合内含子位点促进选择性转录，从而调控下游靶基因和效应器。p53及其调控的信号网络能促进受损细胞的修复、存活或消除，在衰老过程中发挥重要作用。在不同的环境下，p53可选择性临时阻止细胞分裂，启动DNA修复机制，无法使DNA修复时诱导细胞死亡，或者进入DNA复制性衰老状态[23]。动物模型中，衰老与p53活化有关，p53缺失则可抑制衰老表型的发生[24-25]。
综上所述，本研究利用网络药理学方法预测了罗布麻抗衰老的多个成分和多个靶点，并通过动物模型验证了罗布麻可能通过下调p53的表达发挥其抗衰老作用，但其调控p53的上游途径，以及下游靶基因和效应器尚有待进一步探讨。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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