2022, Vol. 29
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是由严重感染、创伤等非心源性疾病诱发，以肺部炎症和通透性增强为主要表现的临床综合征。肺组织通透性增强导致弥漫性肺间质及肺泡水肿，如不纠正就会导致急性缺氧性呼吸衰竭，即急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）的发生[1-2]。ALI进展为ARDS是连续进行性的快速病理过程，临床常难以分清。ALI是全身炎性反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）的肺部表现。SIRS本质是机体遭遇严重损伤时的自我防御反应，如果炎症反应失控，就可能影响重要脏器的功能。SIRS失控通常首先打击肺，导致ALI，甚至ARDS，促发器官序贯损伤且难以逆转[3]。ALI的发生与SIRS的恶性进展密切相关。
机体受到外界强烈损伤因素打击后，进入高度应激状态，分泌大量激素与炎症介质，进而诱发代谢改变。此外，组织器官灌注、患者活动状态和营养支持等也影响机体代谢，患者可表现为高分解代谢紊乱，进一步加重器官功能障碍[3]。危重患者的代谢改变涉及糖、蛋白质、脂类物质合成与分解的多种途径，引起细胞、器官功能的改变。因此，对炎症反应失控进展过程中代谢物的变化进行动态、定量监测，有助于阐明ALI发生发展中代谢模式的变化规律和分子机制。
NMR代谢组学能实现对体液样品快速、非破坏性、重复的定量分析，对危重病的早期诊断具有明显优势[4-8]。本课题组前期研究[6]证实，通过血清NMR谱能区分临床危重病患者早期和后期的代谢紊乱状态。然而，目前有关ALI/ARDS患者代谢物研究[9-10]中的对照组各异，结果不一致，且均未涉及炎症反应早期患者的SIRS状态。
因此，本研究以外伤致SIRS及ALI/ARDS患者为研究对象，采用基于NMR的代谢组学技术，通过其血清高分辨1H-NMR谱图，结合多种模式识别方法，量化分析SIRS患者炎症失控至ALI/ARDS过程中整体代谢组变化，从而寻找疾病进程中主要代谢物改变及关键调控网络，为阐明导致肺损伤代谢紊乱发生的分子机制提供依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象选择2012年9月至2017年9月就诊于复旦大学附属中山医院的创伤危重患者，均为男性，均因车祸、工伤、烧伤等原因入院。SIRS诊断依据美国胸科学会（ATS）标准。ALI/ARDS诊断依据欧洲呼吸与美国胸科学会（ERS/ATS）标准：（1）急性起病；（2）氧合指数降低（ALI：≤300 mmHg，ARDS：≤200 mmHg）；（3）X线示双肺浸润影；（4）肺动脉楔压≤18 mmHg或无左房高压的临床证据。排除标准：（1）恶性肿瘤；（2）内分泌疾病，如糖尿病、甲亢；（3）病理性肥胖（体质量大于正常20%）；（4）既往有慢性器官功能障碍。选择性别、年龄匹配且在2周内未患任何疾病的体检健康者作为对照。研究获本院伦理委员会批准（B2012-56R）；研究对象均签署知情同意书。
1.2 血液样本采集研究对象均禁食或停止肠内/肠外营养8 h后清晨采血。SIRS组、ALI/ARDS组在确诊3 d后采集。所采血液于室温下自然凝固，离心后收集上层血清，－80 ºC保存备用。
1.3 1H-NMR谱测定血清解冻，离心后吸取500 µL上清，移入5 mm NMR专用试管中，加入50 µL重水，在振荡器上混匀。在Varian Unity INOVA 600 MHz核磁共振谱仪上，用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列采集1H-NMR谱。采用预饱和法压制水峰，298 K实验温度，1.64 s采样时间，4 s弛豫延迟时间。每幅NMR谱采集128个自由感应衰减信号（free induction decay，FID），每个FID收集32 000个数据点，充零到64 000个数据点。指数窗函数采用0.3 Hz的线宽进行傅立叶变换。相位和基线校正后，参照乳酸的甲基共振峰（δ1.33），对谱图的化学位移进行定标。
1.4 NMR谱数据处理1H-NMR谱（δ 0.2~10）以0.04/106为单位划分为245个等宽区域，对各区域进行分段积分。再对各积分数据进行归一化，以消除样品浓度、pH、离子强度等的影响。为了消除饱和水峰引起的谱线差异，以及与溶剂交换质子后部分饱和转移所致的尿素信号差异，将δ 4.5~6.0设为0积分段。
1.5 模式识别分析模式识别分析采用SIMCA-P 12（Umetrics AB，瑞典）软件。设置245个分段积分值为自变量、疾病类别为反应变量，分别进行无监督的主成分分析（principal component analysis, PCA）、有监督的偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）[11]。
1.6 代谢物指认和代谢通路分析导出所建PLS-DA模型对应的变量重要性（variable importance in projection, VIP）与回归系数（centered and scaled coefficients, CoeffCS），筛选出与疾病分类相关的NMR积分区段，再结合原始谱图，指认肺损伤发生相关的代谢物。以VIP > 1为标准（一般采用VIP > 0.7），增加统计学可信度和缩小主要NMR积分区段范围，便于代谢物的指认。
热图的绘制主要通过R语言程序包（MetaboAnalyst 5.0）中聚类函数完成。将NMR积分区段数据导入程序，Distance measure设置为Euclidean，Clustering options选择对列数据进行聚类（Cluster column），聚类方法选择Complete，Scale method选择标准化（Normalized）[12]。
采用MetaboAnalyst 5.0软件，将NMR积分区段数据导入网站通路分析模块。先对数据进行缩放变换，再选择Global test算法进行代谢通路富集分析。通过代谢通路富集分析计算代谢物参与每个特定通路的P值，P值越小，代谢通路价值越有统计学意义[13]。并进行通路拓扑分析，以获得代谢物对通路影响程度的大小，即通路影响因子（Impact），其值越大代表代谢物所在通路的重要性越大。
1.7 统计学处理采用SPSS 25.0进行统计分析。数据以x±s表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。所有检验均为双侧，检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 临床及血生化指标共入组41例男性患者，其中创伤致SIRS患者19例，平均年龄（59.89±20.33）岁；创伤致ALI/ARDS 22例，平均年龄（62.14岁±12.72）岁。结果（表 1）显示：SIRS患者APACHE Ⅱ评分及生化指标改变程度较小；与SIRS患者相比，ALI/ARDS患者血乳酸、血糖、降钙素原、C反应蛋白更高（P < 0.01）。
| 指标 | SIRS组（n=19） | ALI/ARDS组（n=22） |
| 年龄/岁 | 59.89±20.33 | 62.14±12.72 |
| APACHE Ⅱ评分 | 12.63±4.90 | 15.14±3.09 |
| 氧合指数/mmHg | 333.63±27.10 | 143.23±26.64 |
| 乳酸/（mmol·L－1） | 2.55±0.86 | 4.95±2.89** |
| 降钙素原/（ng·mL－1） | 2.15±0.78 | 6.41±5.55** |
| C-反应蛋白/（mg·L－1） | 17.39±12.44 | 66.34±60.96** |
| 血糖/（mmol·L－1） | 8.49±1.94 | 14.67±4.03** |
| 三酰甘油/（mmol·L－1） | 1.48±0.53 | 2.46±0.53** |
| 总胆汁酸/（µmol·L－1） | 5.69±3.18 | 15.84±7.24** |
| 丙氨酸氨基转移酶/（U·L－1） | 46.68±17.13 | 52.18±12.64 |
| γ-谷氨酰转移酶/（U·L－1） | 42.58±20.47 | 50.73±30.14 |
| 总胆红素/（µmol·L－1） | 17.54±7.41 | 24.47±7.68* |
| 尿素氮/（µmol·L－1） | 7.54±3.40 | 13.78±8.46** |
| 肌酐/（µmol·L－1） | 110.74±22.05 | 176.50±35.40** |
| 尿酸/（µmol·L－1） | 192.47±78.31 | 278.23±48.29** |
| 1 mmHg=0.133 kPa；*P < 0.05、**P < 0.01与SIRS组相比。 | ||
结果（图 1）显示：PCA法及PLS-DA法分析示，创伤致ALI/ARDS患者血清NMR谱明显不同于健康人。PCA分析无法区分创伤致ALI/ARDS与SIRS患者血清NMR谱；PLS-DA法分析可区分SIRS患者发生ALI甚至ARDS后的代谢模式迁移改变，说明肺损伤导致机体发生缺氧相关代谢改变。
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| 图 1 模式识别分析血清600 MHz 1H-NMR谱 A、B：创伤致ALI/ARDS患者与健康人NMR谱的PCA（A）与PLS-DA（B）分析；C、D：创伤致SIRS患者与ALI/ARDS患者的PCA（C）与PLS-DA（D）分析。椭圆形区域表示95%可信区间。 |
热图（图 2）显示患者总体血清氢谱的聚类差别，其中SIRS患者以左上区域的NMR信号增强为主，ALI与ARDS患者以右下方信号增强为主，提示两组患者血清代谢物存在差异。
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| 图 2 热图展示创伤致SIRS、ALI与ARDS患者的血清1H-NMR谱 |
结果（表 2、表 3、图 3A）显示：根据PLS-DA模型对应的变量VIP及CoeffCS，SIRS组患者血清NMR氢谱积分区段为δ7.18~7.22和δ1.90~1.94，主要为酪氨酸、赖氨酸等生酮氨基酸的谱峰；ALI/ARDS组积分区段为δ1.02~2.50和δ3.02~4.14，主要代谢物为乳酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酸等多种生糖氨基酸，以及丙酮酸、肌酸、脂质的脂肪酸、甘油等谱峰。SIRS患者以生酮氨基酸升高为主，提示炎症反应促使脂肪氧化代谢加速；肺损伤发生时，生糖氨基酸升高更显著，说明缺氧促进糖异生/糖酵解以快速为生物体供能。
| 编号 | 化学位移 | CoeffCS | VIP | 代谢物 |
| 1 | δ1.02~1.06 | －0.0182 | 2.55 | 缬氨酸 |
| 2 | δ3.02~3.06 | －0.0178 | 2.50 | 肌酸的CH3 |
| 3 | δ2.34~2.38 | －0.0167 | 2.34 | 丙酮酸、谷氨酸 |
| 4 | δ1.86~1.90 | －0.0135 | 1.89 | 醋酸盐 |
| 5 | δ4.10~4.14 | －0.0128 | 1.79 | 乳酸 |
| 6 | δ1.70~1.74 | －0.0122 | 1.71 | 精氨酸 |
| 7 | δ7.38~7.42 | －0.0115 | 1.61 | 苯丙氨酸 |
| 8 | δ1.30~1.34 | －0.0114 | 1.60 | 乳酸 |
| 9 | δ2.42~2.46 | －0.0106 | 1.48 | 琥珀酸 |
| 10 | δ2.46~2.50 | －0.0100 | 1.40 | 谷氨酰胺 |
| 11 | δ1.66~1.70 | －0.0091 | 1.27 | 精氨酸 |
| 12 | δ1.46~1.50 | －0.0087 | 1.21 | 丙氨酸 |
| 13 | δ1.26~1.30 | －0.0085 | 1.20 | 脂肪酰基链的（CH2）n、CH2CH2CH2CO |
| 14 | δ3.54~3.58 | －0.0085 | 1.19 | 甘油的CH2OH |
| 15 | δ7.02~7.06 | －0.0067 | 1.04 | 组氨酸 |
| 16 | δ1.18~1.22 | －0.0073 | 1.02 | 3-羟基丁酸酯 |
| 17 | δ7.18~7.22 | 0.0095 | 1.33 | 酪氨酸 |
| 18 | δ1.90~1.94 | 0.0076 | 1.07 | 赖氨酸 |
| CoeffCS为负值表示对应的血清代谢物浓度在ALI/ARDS组患者中较SIRS组高，正值相反。 | ||||
| 组别 | 化学位移区段 | 代谢物 |
| SIRS | δ7.18~7.22 | 酪氨酸 |
| δ1.90~1.94 | 赖氨酸 | |
| ALI/ARDS | δ1.02~2.50 | 缬氨酸、乳酸、醋酸盐、丙酮酸、 |
| 谷氨酸、琥珀酸、谷氨酰胺、精氨酸、 | ||
| 丙氨酸、脂肪酸、3-羟基丁酸酯 | ||
| δ3.02~4.14 | 肌酸、乳酸、甘油 | |
| δ7.02~7.06 | 组氨酸 | |
| δ7.38~7.42 | 苯丙氨酸 |
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| 图 3 肺损伤发生相关代谢物及代谢通路 A：PLS-DA分析中代谢物重要性，灰色柱表示SIRS组升高的代谢物，红色柱为ALI/ARDS相关代谢物；B：代谢通路，气泡越大，表示影响因子值越大；颜色越深，表示-In P值越大，相应的代谢通路越有可能参与肺损伤。 |
根据上述指认的ALI/ARDS相关代谢物（图 3A），进行代谢通路富集分析，共筛选出11个代谢通路，其中氨酰tRNA合成、氰基氨基酸代谢、氮代谢、卟啉叶绿素代谢、谷胱甘肽代谢及半乳糖代谢的影响强度值均约为0，说明其对疾病发生的影响小；糖酵解、糖异生、丙酮酸代谢、甘油酯代谢、精氨酸代谢、初级胆汁酸合成等通路的激活参与肺损伤发生（图 3B）。
3 讨论ALI/ARDS是ICU患者死亡的重要原因，是严重创伤等因素诱发全身炎症反应的肺部表现。本研究从整体代谢组入手，对创伤致SIRS与ALI/ARDS患者的血清NMR氢谱进行PLS-DA模式识别分析，监测到炎症反应失控导致肺损伤时的系统代谢改变。如果炎症反应失控影响肺泡上皮及其表面活性物质，则会引起肺损伤，导致呼吸功能障碍，机体缺氧。此时无氧糖酵解产生的ATP成为主要热量来源，以提供呼吸肌及应激反应所需的能量；丙酮酸为糖酵解终产物，缺氧时在细胞浆中还原成乳酸供能。丙酮酸的来源除了糖酵解，还可由丙氨酸通过转氨基作用生成。同时，丙酮酸、乳酸、氨基酸、甘油等非糖物质可通过糖异生转变为糖原或葡萄糖，为糖酵解提供物质来源。此外，缬氨酸水平增加可能与肺损伤时肺泡表面活性蛋白C的水解有关[14]。脂质可通过PI3K/AKT/NF-κB通路参与机体氧化应激，为ARDS发生的独立标志物之一[15-16]。本研究表明，糖酵解、糖异生、丙酮酸代谢、甘油酯代谢作为主要的代谢通路，协同推进肺损伤进程。这些代谢改变与临床上肺损伤患者血糖与乳酸升高、氧合指数降低符合，而肺损伤时缺氧所致的二氧化碳潴留及乳酸的积聚可共同促使机体酸中毒[17]。
肺损伤时，精氨酸代谢活化与尿素、肌酸及NO的产生有关。蛋白质分解产生的氨基酸增多，相应升高的血氨则须通过精氨酸介导的鸟氨酸循环生成尿素后排出。同时，精氨酸和脯氨酸为应激压力物质，皆为生糖氨基酸，在炎症进展中为机体能量的来源之一[18]。谷氨酸除参与精氨酸代谢外，还与T细胞介导的免疫调节相关。谷氨酸水平升高与ARDS患者的代谢功能障碍相关[19]。缺氧导致呼吸困难，呼吸肌过度运动又促进肌酸产生，肌酸最终转变为肌酐。NO作为应激活性物质，通过精氨酸-NO通路在ALI/ARDS中发挥重要的调节作用[20]。这些代谢紊乱与ALI/ARDS患者尿素氮、肌酐指标的升高有关。
初级胆汁酸在肝脏中由胆固醇转化而来，可能与脂肪动员甘油酯分解产生的脂肪酸增多及丙酮酸生成增加有关。同时，随着炎症反应进展，肝脏还需要将更多的葡萄糖转化为脂肪酸和脂质。这些代谢过程都会加重肝脏负担，导致肝内胆汁淤积，甚至肝功能障碍，从而使肺损伤患者出现总胆汁酸、转氨酶、胆红素等临床指标的升高。
根据鉴定到的代谢物及代谢通路，结合临床指标，本研究推测肺损伤发生的代谢紊乱机制为：在创伤等因素打击下，机体处于高度应激状态，炎症细胞和炎症因子网络共同推动炎症反应进展，引发体内一系列代谢改变。早期阶段，糖原和骨骼肌蛋白质分解，导致血液中糖和氨基酸升高；随着炎症反应进展，储存的脂肪动员并氧化为主要热量来源，以代替消耗性糖原和蛋白质，作为血液中脂肪分解终产物的游离脂肪酸和甘油随之增加。总之，全身炎症反应导致机体发生以高分解代谢为特征的代谢紊乱（图 4）。
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| 图 4 SIRS患者肺损伤发生时可能的代谢紊乱机制 红色字体显示指认的创伤致ALI/ARDS患者升高的代谢物；红色方框指示肺损伤发生的关键代谢通路；灰色椭圆形框显示患者临床相关指标。 |
综上所述，本研究提示，创伤等应激因素打击下，体内炎症细胞与炎症因子网络被激发导致全身炎症反应，诱发糖、蛋白质、脂类物质高分解代谢；一旦炎症反应影响肺泡，导致肺泡上皮和表面活性物质改变，就会引起呼吸功能障碍，导致机体缺氧、二氧化碳潴留，继而引发以糖酵解、糖异生、丙酮酸代谢、甘油酯代谢、精氨酸代谢、初级胆汁酸合成等通路激活为特征的系统代谢紊乱。本研究表明通过血清1H-NMR谱能识别创伤致SIRS至发生ALI/ARDS后患者的代谢改变情况。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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