2022, Vol. 29
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是多种因素共同作用而导致免疫功能异常的自身免疫性疾病，可累及全身多种组织和器官。SLE的主要特征是产生大量自身抗体，形成免疫复合物在组织中沉积，导致补体激活，自身反应性细胞增多[1-2]。滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，TFH）作为一类特殊的CD4+ T细胞亚群，其主要作用是辅助B细胞分化增殖、抗体分泌，B细胞产生大量自身免疫性抗体，造成SLE免疫炎症损伤[3-4]。TFH细胞及分泌的IL-21增多与SLE病情活动度、自身抗体分泌正相关[5-6]。
青蒿素及其衍生物除抗疟作用外，双氢青蒿素高效且低毒，有较明显的免疫抑制作用，有良好开发前景，但有关双氢青蒿素治疗SLE的免疫研究机制仍较少[7-10]。有研究[11]表明，双氢青蒿素在SLE中发挥免疫调节作用，通过调节Th17/Treg平衡，抑制Th17细胞分化及促炎作用，促进Treg细胞分化及其免疫抑制作用。迄今未发现关于双氢青蒿素对狼疮鼠体内外TFH细胞的调控研究。本研究旨在探讨双氢青蒿素对狼疮鼠的治疗作用，及其在体内外对TFH细胞分化的调控作用，为双氢青蒿素应用于红斑狼疮治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料雌性MRL/lpr狼疮鼠购买自中科院上海生命科学院斯莱克实验动物有限公司；双氢青蒿素（相对分子质量284.35）购买自CSNpharm公司；IL-21和IL-6于Peprotech公司购买；初始CD4+ T细胞分选试剂盒和T细胞活化/扩增试剂盒购买自德国美天旎公司（Miltenyi Biotec）；尿蛋白检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所；异硫氰酸荧光素（FITC）-CD4流式抗体、别藻蓝蛋白（APC）-CXCR5流式抗体、藻红蛋白（PE）-PD-1流式抗体均来自于BD公司。IL-21酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购买自R & D Systems公司。
1.2 实验动物分组及处理12只12周龄的雌性MRL/lpr鼠，饲养于我院SPF级动物房，体质量（30.1±2.1）g。随机数字表法将小鼠随机分为2组，双氢青蒿素治疗组和对照组，每组各6只。通过查阅相关文献[11-13]及咨询CSNpharm公司实验人员，100~150 mg/kg双氢青蒿素灌胃治疗可有效治疗狼疮症状。本研究体内实验予150 mg/kg双氢青蒿素灌胃给药，1次/d，持续给药4至16周，对照组以同样方法PBS溶液灌胃给药。治疗结束时使用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白，之后处死狼疮鼠，取脾称重，剪碎研磨脾脏从其中分离单个核细胞，之后用FITC-CD4、PE-PD-1、APC-CXCR5流式抗体，4℃避光染色20 min，上机检测圈出CD4+ T淋巴细胞，再从CD4+ T的淋巴细胞图中圈出PD-1+和CXCR5+的淋巴细胞，计算CXCR5+ PD-1+淋巴细胞在CD4+细胞中的百分比。取肾脏，放入4%多聚甲醛固定，其后经脱水透明处理后，样品浸蜡包埋，病理切片机切片，根据H-E染色进行肾脏病理评分，评分方法参考该文献[14]。收集血清，ELISA试剂盒检测治疗组和对照组抗ds-DNA抗体及ANA抗体含量。
1.3 体外TFH细胞培养诱导分化及流式检测从对照组MRL/lpr狼疮鼠中分离单个核细胞，初始CD4+ T细胞试剂盒分选初始CD4+ T细胞，在细胞培养液中加入10 ng/mL IL-21、20 ng/mL IL-6和T细胞活化/扩增试剂盒中的MACSiBeads Particles诱导分化5 d，不同浓度梯度（0 μM、0.1 μM、1.0 μM、10 μM）双氢青蒿素干预，共分为4组。体外培养5 d后，用FITC-CD4、PE-PD-1、APC-CXCR5流式抗体4℃避光染色20 min，流式细胞仪检测CD4+ CXCR5+ PD-1+ T细胞在CD4+ T细胞中的比例。
1.4 IL-21水平测定收集上述TFH细胞培养上清，根据IL-21 ELISA试剂盒说明书检测TFH细胞分化过程中分泌的IL-21含量。
1.5 统计学处理采用GraphPad Prism 7.0软件，通过Student t检验和方差分析进行统计学分析，计量资料以x±s表示。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 双氢青蒿素对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用结果（图 1、表 1）显示：双氢青蒿素系统治疗MRL/lpr小鼠4周后与对照组相比较，24 h尿蛋白含量更低，分别为（1 536±150.1）μg/24 h和（2 548±93.30）μg/24 h，t＝5.726，P＜0.01。双氢青蒿素治疗组肾脏病理评分是2.410±0.535，对照组为5.713±0.662，t＝6.716，P＜0.01。治疗组抗ds-DNA抗体低于对照组[（345.3±29.00）vs（477.8±20.07）IU/mL，t＝7.514，P＜0.01]，治疗组ANA抗体也低于对照组[（514.5±19.64）vs（726.3±16.27）IU/mL，t＝8.302，P＜0.01]。
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| 图 1 双氢青蒿素治疗MRL/lpr狼疮鼠肾炎H-E染色图 A：对照组；B：双氢青蒿素治疗组。治疗组肾小球、小管及血管周围炎细胞浸润减少。Original magnification：×40。 |
| 组别 | 尿蛋白/(μg•24 h－1) | 肾脏病理评分 | 抗ds-DNA抗体/(IU•mL－1) | ANA抗体/(IU•mL－1) |
| 治疗组（n=6） | 1 536±150.10 | 2.410±0.535 | 345.3±29.00 | 514.5±19.64 |
| 对照组（n=6） | 2 548±93.30 | 5.713±0.662 | 477.8±20.07 | 726.3±16.27 |
| t值 | 5.726 | 6.716 | 7.514 | 8.302 |
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 |
双氢青蒿素治疗MRL/lpr狼疮鼠4周后，可有效抑制MRL/lpr狼疮鼠脾脏增生，治疗组脾脏重量（0.28±0.03）g，对照组（0.69±0.04）g（t＝13.83，P＜0.01）。双氢青蒿素治疗组和对照组脾脏中TFH细胞比例分别为（12.40%±2.726%）和（36.33%±2.750%），t＝10.71，P＜0.01，见图 2。体外培养TFH细胞，0 μM与0.1 μM、1.0 μM、10 μM双氢青蒿素干预，CD4+CXCR5+PD-1+ TFH细胞比例和分泌的IL-21水平随着双氢青蒿素浓度增加而降低，相邻2组间差异均有统计学意义（图 3）。
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| 图 2 流式检测MRL/lpr狼疮鼠脾脏中CD4+ CXCR5+ PD-1+ TFH细胞百分比 空白组：未染色对照，以区分细胞的自发荧光和特异性荧光。CXCR5：C-X-C趋化因子受体5；PD-1：程序性死亡蛋白1。 |
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| 图 3 双氢青蒿素体外抑制MRL/lpr狼疮鼠TFH细胞分化及其IL-21的分泌 A、B：流式检测示双氢青蒿素抑制TFH细胞分化；C：流式检测示双氢青蒿素抑制细胞因子IL-21的分泌，且抑制具有剂量依赖性，随着双氢青蒿素浓度增加，TFH细胞分化比例、IL-21含量降低。*P＜0.05，**P＜0.01。 |
SLE是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病，目前主要的治疗药物为糖皮质激素，某些特定类型的SLE亦可使用环磷酰胺和生物制剂等免疫抑制剂，但长期使用糖皮质激素和免疫抑制药物会引起诸多严重不良反应。因此，进一步研究SLE免疫学发病机制，寻找新的高效低毒治疗药物，对提高SLE诊疗水平具有重要意义。
SLE是一种以B细胞过度活化和致病性自身抗体形成增加为特征、累及全身系统器官的自身免疫性疾病。TFH细胞主要辅助B细胞向浆细胞分化、促进抗体分泌。诸多前期研究[5, 15]发现SLE患者外周血中TFH细胞比例增多，与自身抗体滴度正相关，并与SLE病情活动密切相关。在MRL/lpr狼疮鼠中也证实TFH细胞和其分泌的IL-21与生发中心扩增和自身抗体分泌密切相关[6]。SLE发病与TFH细胞过度活化和IL-21过量分泌密切相关，因此抑制TFH细胞分化和功能可能进一步抑制B细胞过度活化和抗体分泌，从而TFH细胞可作为治疗SLE的有效靶点[16]。
自屠呦呦教授团队因研发青蒿素获诺贝尔奖后，青蒿素及其衍生物的研究备受关注。青蒿素化学结构中含过氧桥结构，可产生大量水溶性和脂溶性衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等。双氢青蒿素除有抗疟疾作用外，还具有免疫调节作用[7, 17-18]。例如，有研究[9]显示，双氢青蒿素衍生物DC32通过恢复Treg/Th17平衡和下调IL-6来减轻小鼠胶原诱导的关节炎。双氢青蒿素通过抑制MRL/lpr鼠中Toll样受体4信号通路的激活和脾细胞中Ⅰ型干扰素的产生进而缓解狼疮炎症损伤[13]。本研究发现双氢青蒿素可有效缓解狼疮鼠肾脏损伤，降低24 h尿蛋白、抗ds-DNA抗体和ANA抗体滴度，可有效抑制狼疮鼠脾脏增生、抑制TFH细胞增生。体外研究表明，双氢青蒿素可剂量依赖性抑制TFH细胞分化及IL-21的分泌，提示双氢青蒿素可能通过抑制TFH细胞扩增分化及其细胞因子分泌，从而达到治疗狼疮的作用。
综上所述，本研究仅从双氢青蒿素对TFH细胞的影响揭示了部分治疗机制，而缓解狼疮发病的其他机制还有待更多研究。双氢青蒿素具有较为明确的抗炎和免疫调节作用，随着相关研究的增多，有望应用于SLE等自身免疫性疾病的治疗。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
| [1] |
PETTY A J, FLOYD L, HENDERSON C, et al. Cutaneous lupus erythematosus: progress and challenges[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2020, 20(5): 12.
[DOI]
|
| [2] |
TSOKOS G C, LO M S, REIS P C, et al. New insights into the immunopathogenesis of systemic lupus erythematosus[J]. Nat Rev Rheumatol, 2016, 12(12): 716-730.
[DOI]
|
| [3] |
YAN L, DE LEUR K, HENDRIKS R W, et al. T follicular helper cells as a new target for immunosuppressive therapies[J]. Front Immunol, 2017, 8: 1510.
[DOI]
|
| [4] |
NURIEVA R I, CHUNG Y, HWANG D, et al. Generation of T follicular helper cells is mediated by interleukin-21 but independent of T helper 1, 2, or 17 cell lineages[J]. Immunity, 2008, 29(1): 138-149.
[DOI]
|
| [5] |
RANKIN A L, MACLEOD H, KEEGAN S, et al. IL-21 receptor is critical for the development of memory B cell responses[J]. J Immunol, 2011, 186(2): 667-674.
[DOI]
|
| [6] |
YANG X, YANG J, CHU Y, et al. T follicular helper cells and regulatory B cells dynamics in systemic lupus erythematosus[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e88441.
[DOI]
|
| [7] |
ZHAO Y G, WANG Y, GUO Z, et al. Dihydroartemisinin ameliorates inflammatory disease by its reciprocal effects on Th and regulatory T cell function via modulating the mammalian target of rapamycin pathway[J]. J Immunol, 2012, 189(9): 4417-4425.
[DOI]
|
| [8] |
DANG W, LI H, JIANG B, et al. Therapeutic effects of artesunate on lupus-prone MRL/lpr mice are dependent on T follicular helper cell differentiation and activation of JAK2-STAT3 signaling pathway[J]. Phytomedicine, 2019, 62: 152965.
[DOI]
|
| [9] |
LI Y, FAN M, LIU H, et al. Dihydroartemisinin derivative DC32 inhibits inflammatory response in osteoarthritic synovium through regulating Nrf2/NF-κB pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 74: 105701.
[DOI]
|
| [10] |
LIU X, LU J, LIAO Y, et al. Dihydroartemisinin attenuates lipopolysaccharide-induced acute kidney injury by inhibiting inflammation and oxidative stress[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 117: 109070.
[DOI]
|
| [11] |
CHEN Y, TAO T, WANG W, et al. Dihydroartemisinin attenuated the symptoms of mice model of systemic lupus erythematosus by restoring the Treg/Th17 balance[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2021, 48(4): 626-633.
[DOI]
|
| [12] |
LI W, DONG Y, TU Y, et al. Dihydroarteannuin ameliorates lupus symptom of BXSB mice by inhibiting production of TNF-alpha and blocking the signaling pathway NF-kappa B translocation[J]. Int Immunopharmacol, 2006, 6(8): 1243-1250.
[DOI]
|
| [13] |
HUANG X, XIE Z, LIU F, et al. Dihydroartemisinin inhibits activation of the Toll-like receptor 4 signaling pathway and production of type Ⅰ interferon in spleen cells from lupus-prone MRL/lpr mice[J]. Int Immunopharmacol, 2014, 22(1): 266-272.
[DOI]
|
| [14] |
WATSON M L, RAO J K, GILKESON G S, et al. Genetic analysis of MRL-Ipr mice: relationship of the Fas apoptosis gene to disease manifestation and renal disease-modifying loci[J]. J Exp Med, 1992, 176(6): 1645-1656.
[DOI]
|
| [15] |
KIM S J, LEE K, DIAMOND B. Follicular helper T Cells in systemic lupus erythematosus[J]. Front Immunol, 2018, 9: 1793.
[DOI]
|
| [16] |
YANG X, YANG J, CHU Y, et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e62855.
[DOI]
|
| [17] |
NOORI S, HASSAN Z M, TAGHIKHANI M, et al. Dihydroartemisinin can inhibit calmodulin, calmodulin-dependent phosphodiesterase activity and stimulate cellular immune responses[J]. Int Immunopharmacol, 2010, 10(2): 213-217.
[DOI]
|
| [18] |
NOORI S, HASSAN Z M. Dihydroartemisinin shift the immune response towards Th1, inhibit the tumor growth in vitro and in vivo[J]. Cell Immunol, 2011, 271(1): 67-72.
[DOI]
|
