2022, Vol. 29
2. 复旦大学附属中山医院内镜中心, 上海 200032
2. Endoscopy Center, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
内镜下黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）是一种微创手术，住院时间短，广泛应用于胃肠道浅表肿瘤性病变。然而，由于手术过程中缺损的黏膜暴露于胃肠道菌群中，可能会出现菌血症和（或）内毒素血症。发热可能是手术感染的第1个临床症状。美国胃肠内镜协会（ASGE）建议ESD手术期间不需常规使用抗生素预防感染，因为菌血症发生较少且一般持续时间较短[1]。尽管菌血症的发生率较低，但这种情况可能会引发感染性心内膜炎等严重感染，导致严重后果。因此，依靠血清标志物及早发现细菌感染并评估其严重程度是极其重要的。
在目前的研究[2-4]中，前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）被证明是感染期间先天性免疫应答的关键调节因子，PCSK9在感染性休克中被证实快速上调。在肠源性内毒素血症肝硬化大鼠中，肝脏PCSK9表达明显增加[5]。在盲肠结扎穿刺诱导的脓毒症小鼠中，PCSK9过表达也会加剧IL-6的产生[3]。因食管具有壁薄、易出血、靠近重要器官和动脉的特征，食管ESD比胃和结直肠病变更困难，风险更大，术后感染状态的监测非常重要。本研究旨在评估PCSK9对食管ESD后早期感染和感染严重程度的预测价值。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2017年3月1日至2017年10月30日在复旦大学附属中山医院被诊断为食管浅表病变并接受ESD治疗的65例患者。排除标准：（1）在过去7 d内以任何理由使用抗生素；（2）在ESD手术期间出现任何其他感染迹象；（3）患有慢性非传染性炎症性疾病，如自身免疫性疾病、炎症性肠病；（4）在ESD前1 d体温高于37℃；（5）出现内镜下治疗引起的并发症，如穿孔或大出血等；（6）患有高脂血症。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（Y2016-156）。
ESD的手术指征：食管的高级别上皮内瘤变或超声内镜证实侵入深度仅限于食管黏膜层的肿瘤，且由CT证实无淋巴结或远处转移。
1.2 ESD手术过程在病灶外缘5 mm处进行电凝标记（APC300, ERBE），向黏膜下组织注射少量生理盐水、肾上腺素、靛胭脂（10∶1∶5）配制的液体，以抬起病变。使用钩刀（KD-620LR，奥林巴斯）或绝缘头刀（KD-611L，IT2，奥林巴斯）进行黏膜切开及黏膜下剥离，同时使用凝固器（FD-410LR，奥林巴斯）止血。
1.3 围手术期管理住院期间监测感染性和出血性并发症。在围手术期，如果没有观察到感染的临床迹象，则不使用预防性抗生素。ESD后评估手术时间、伤口大小和体温。计算从电凝标记到创面凝固完成的时间。将切除的标本放置于软木板上平整拉开，用大头针固定，取标本最大的长度和宽度计算伤口区域。如果同时切除≥2个病灶，则将其总数作为一个区域处理。
所有患者ESD后每日监测体温，达到37.5℃及以上为发热标准，体温≥38℃时进行血培养。术前及术后第1天上午检测外周血白细胞计数（white blood cell，WBC）、中性粒细胞计数、C-反应蛋白（CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子及血清脂多糖、PCSK9水平，评估炎症反应，并同时检测肝肾功能等。如果患者术后第2天没有胸痛、呼吸困难等症状，则开始流质饮食。
1.4 血培养当体温达到38℃时，抽取2套静脉血行需氧菌、厌氧菌及真菌培养以评估感染情况。血液样本在35℃下培养3 d，如果有细菌生长，则行微生物鉴定及抗生素敏感试验。
1.5 ELISA检测血清LPS和PCSK9采集血液样本置于含有促凝剂的采血管中，30 min内1 000 r/min离心15 min，收取上层血清保存于－80℃。根据说明书，使用ELISA分别测定血清LPS（武汉华美）和PCSK9（R & D systems DPC900）水平。
1.6 统计学处理采用SPSS 23.0或GraphPad Prism 6.0进行统计分析。数据以x±s或M（P25, P75）进行汇总。组间差异根据数据分布情况通过Student’s t检验、配对样本t检验、单因素方差分析、秩和检验确定。采用Pearson相关系数评估血清PCSK9与LPS水平的关系。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 一般资料分析结果（表 1）显示：共纳入患者65例，中位年龄为57岁，53.85%为男性。围手术期患者肝肾功能无明显改变。所有靶病灶均进行完整切除，侧切缘和基底缘均未发现肿瘤浸润。病理诊断为高级别上皮内瘤变、鳞状细胞癌或腺癌，局限于SM1（＜200 μm）。中位手术时间为47.0（36.0，59.5）min，平均切除病灶面积为（9.23±4.65）cm2。
| 指标 | 结果 |
| 年龄/岁 | 57(53, 61) |
| 性别n(%) | |
| 男 | 35(53.85) |
| 女 | 30(46.15) |
| 创面大小/cm2 | 9.23±4.65 |
| 手术时间/min | 47.0(36.0，59.5) |
| 病理类型n(%) | |
| 高级别上皮内瘤变 | 32(49.23) |
| 鳞状细胞癌 | 30(46.15) |
| 腺癌 | 3(4.62) |
| 术后最高体温n(%) | |
| ＜37.5℃ | 28(43.08) |
| 37.5~37.9℃ | 25(38.46) |
| ≥38℃ | 12(18.46) |
| 血培养阳性n(%) | 1(1.54) |
ESD后第1天出现发热者37例，体温达38℃者12例，其中1例最高体温达39℃，血培养脆弱拟杆菌阳性，对常用抗生素敏感，且该患者术后PCSK9水平最高。WBC最高24.15×109/L、中性粒细胞计数最高21×109/L、血清PCSK9最高水平461.67 ng/mL、IL-6最高水平为86.3 pg/mL。体温37.5~37.9℃的患者根据症状、化验结果等确定是否给予抗生素治疗，12例体温达到38℃的患者均给予抗生素治疗，所有发热患者体温均在2 d内恢复正常。
2.2 ESD前后炎症相关指标的比较结果（表 2）显示：术后WBC、中性粒细胞计数、CRP、IL-6均较ESD前明显升高。而ESR、TNF-α无明显差异。
| 指标 | ESD前 | ESD后 | P值 |
| 白细胞计数/(×109·L－1) | 6.19±1.26 | 11.04±3.26 | ＜0.001 |
| 中性粒细胞计数/(×109·L－1) | 3.97±1.02 | 9.15±3.04 | ＜0.001 |
| C-反应蛋白/(mg·L－1) | 1.20 (0.55, 2.10) | 8.80 (3.10, 14.65) | ＜0.001 |
| 白介素6/(pg•mL－1) | 1.0 (1.0, 2.4) | 8.6 (4.9, 27.1) | ＜0.001 |
| 血沉/(mm•h－1) | 9.0 (6.0, 16.0) | 11.0 (5.5, 18.5) | 0.059 |
| 肿瘤坏死因子α/(pg•mL－1) | 5.30 (4.60, 6.25) | 5.70 (4.20, 6.55) | 0.757 |
进一步检测ESD前后第1天的血清LPS和PCSK9水平（图 1）发现，术后患者血清LPS水平明显升高[（233.69±43.79）pg/mL vs（269.29±52.11）pg/mL，P＜0.001]。同时PCSK9水平也明显升高[（230.97±37.14）ng/mL vs（301.24±60.92）ng/mL，P＜0.001]。
|
| 图 1 ESD前后患者血清LPS和PCSK9水平的变化 LPS：脂多糖，PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9；***P＜0.001。 |
为明确炎症标志物与体温升高的相关性，将患者按术后体温高低分组后进行比较，结果（表 3）发现：与体温＜37.5℃组相比，体温≥37.5℃组术后的WBC、中性粒细胞计数、CRP、IL-6、LPS、PCSK9水平明显更高。
| 指标 | 体温＜37.5℃组（n＝28） | 体温≥37.5℃组（n＝37） | P值 |
| 白细胞计数/(×109·L－1) | 10.00±2.79 | 11.83±3.40 | 0.024 |
| 中性粒细胞计数/(×109·L－1) | 8.18±2.44 | 9.89±3.24 | 0.022 |
| CRP/(mg·L－1) | 4.45 (1.95, 9.83) | 11.00 (5.10, 16.35) | 0.019 |
| IL-6/(pg•mL－1) | 5.7 (3.2, 9.8) | 12.0 (6.1, 34.7) | 0.015 |
| LPS/(pg•mL－1) | 251.53±55.03 | 282.73±46.10 | 0.016 |
| PCSK9/(ng•mL－1) | 275.44±47.08 | 320.76±63.45 | 0.002 |
| CRP：C-反应蛋白；IL-6：白介素6；LPS：脂多糖；PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9。 | |||
结果（表 4、图 2）显示：12例体温≥38℃的患者均进行血培养，最终只有1例阳性（PCSK9 461.67 ng/mL、IL-6 6.0 pg/mL、LPS 340.00 pg/mL）。为明确感染情况，将发热队列分为37.5℃≤体温＜38℃组和体温≥38℃组。体温≥38℃组WBC、中性粒细胞计数均高于37.5℃≤体温＜38℃组，但差异无统计学意义，而血清PCSK9和IL-6升高（P＜0.05）。体温≥38℃组PCSK9、IL-6的均值和中位数分别为（355.29±56.17）ng/mL、31.8（13.3, 45.6）pg/mL，37.5℃≤体温＜38℃组为（304.19±60.91）ng/mL、10.2（5.0, 16.4）pg/mL（P＝0.020，P＝0.017）。
| 指标 | 37.5℃≤体温＜38℃组（n＝25） | 体温≥38℃组（n＝12） | P值 |
| 白细胞计数/(×109·L－1) | 11.39±3.40 | 12.75±3.34 | 0.259 |
| 中性粒细胞计数/(×109·L－1) | 9.33±3.22 | 11.05±3.07 | 0.133 |
| CRP/(mg·L－1) | 10.25(4.80, 15.85) | 14.65(9.43, 23.68) | 0.380 |
| LPS/(pg•mL－1) | 286.99±46.94 | 273.86±44.94 | 0.425 |
| PCSK9/(ng•mL－1) | 304.19±60.91 | 355.29±56.17 | 0.020 |
| IL-6/(pg•mL－1) | 10.2 (5.0, 16.4) | 31.8 (13.3, 45.6) | 0.017 |
| CRP：C-反应蛋白；LPS：脂多糖；PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9；IL-6：白介素6。 | |||
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| 图 2 37.5℃≤体温＜38℃组与体温≥38℃组患者术后血清PCSK9和IL-6水平 PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9；IL-6：白介素6；T：体温；*P＜0.05。 |
结果（图 3）显示：对于体温≥38℃患者，ESD术后血清PCSK9与LPS水平的相关系数为0.720（P＝0.011）。
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| 图 3 体温≥38℃患者ESD术后血清PCSK9与LPS水平的相关性 LPS：脂多糖；PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9。 |
本研究率先探讨血清PCSK9水平在检测ESD后早期感染的价值。根据ASGE指南[6]，在食管扩张、静脉曲张硬化治疗、内镜下逆行胰胆管造影术和超声内镜引导下细针穿刺活检中，提倡适当预防性使用抗生素，其他内镜下黏膜切除术或ESD不需要常规的围手术期抗生素预防。术后菌血症的发生率很低，食管近1%[7]、胃2%~4%[8-9]、结直肠0~2.5%[10-11]，而术后内毒素血症可能与炎症反应有关[9]。ESD手术后出现不同程度的发热，临床医生很难确定是否由感染引起。由于血培养所需时间较长且阳性率较低，炎症标志物如CRP、ESR和降钙素原被广泛应用。然而，其局限性在一定程度上仍然存在。CRP在许多非感染性疾病中也有升高[12]；而ESR半衰期长，在评估慢性炎症方便作用较大[13]；降钙素原广泛用于评估全身性感染，特别是败血症，但其在局部感染的评估方面可能作用较为有限[14]。因此，需要一种新的生物标志物来帮助识别是否存在ESD术后感染及其严重程度。
PCSK9是一种丝氨酸蛋白酶，可通过低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）抑制循环中内源性脂质清除以调节高胆固醇血症[15]。LDLR可结合病原菌脂质，如革兰阴性细菌的脂多糖[16]和真菌的磷脂甘露聚糖[17]，将其从血液中清除。PCSK9在分泌进入循环之前主要在肝细胞中产生[18]，在小肠、肾脏和大脑中也有少量产生[19]。PCSK9在冠心病等动脉粥样硬化疾病的发病中发挥重要作用[20]，此外，PCSK9在感染中也发挥一定作用。感染特别是内毒素引起的感染，可上调PCSK9的产生。PCSK9过表达可导致肝细胞LDLR降低，从而降低肝脏对病原体脂质（包括LPS）的清除率[21]。肝脏解毒功能的丧失加速了全身细菌传播，导致多器官衰竭和组织炎症，因此，PCSK9可能成为一种新的识别体内感染状态的生物标志物。
本研究发现ESD前后WBC、中性粒细胞计数、CRP、IL-6、LPS和PCSK9水平存在显著差异，均在术后明显升高。这可能与ESD引起多种不同程度的炎症反应相关。同时，术后ESR和TNF-α并没有明显的升高，这可能是由于这些标志物不能反映较早期的炎症水平。
为了确定PCSK9与ESD术后感染的关系，本研究按体温区间分层分析了血清PCSK9和LPS浓度发现，65例患者中发热37例，体温≥38℃者12例。与体温＜37.5℃组相比，发热组血清LPS、PCSK9和IL-6水平显著升高。因此内毒素血症可能是发热的主要原因。而在体温≥38℃和37.5℃≤体温＜38℃ 2组中，LPS浓度无显著差异，这可能与本研究样本量不够充足有关。与LPS不同的是，血清PCSK9的水平与体温的升高保持同步。
本研究中血培养阳性患者PCSK9水平最高，提示PCSK9的快速变化可能是菌血症的可靠指标。IL-6是一种主要由巨噬细胞在识别病原体相关分子模式后迅速产生的细胞因子，表现出的变化趋势与血清PCSK9相同。在盲肠结扎穿孔术诱导的脓毒症小鼠中，血清IL-6在脓毒症早期增加，并随着穿孔修复而下降，并与PCSK9的过表达相关[22]。虽然本研究中没有发现PCSK9和IL-6之间的显著相关性，但PCSK9在早期感染中升高似乎仍然具有一定的意义。
此外，鉴于体温≥38℃组中LPS和PCSK9的平均浓度较高，进一步检测这2个指标是否存在相关性，发现其相关系数为0.720（P＝0.011）。因此，体温≥38℃时，PCSK9与LPS水平密切相关，这可能与细菌感染的刺激和PCSK9的增加抑制其降解有关。由于本研究样本中体温≥38℃的患者数量有限，后续需要扩样本量进行进一步研究，以验证目前的研究结果，从而明确不同感染的严重程度的PCSK9水平的阈值。
综上所述，本研究扩展了PCSK9对ESD后早期感染的预测作用。循环PCSK9水平在严重感染（如败血症）时显著升高。食管ESD相关内毒素血症可能与炎症反应密切相关；PCSK9有潜力成为检测ESD围手术期感染状态的敏感和早期诊断标志物。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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