2022, Vol. 29
2. 上海市肾病与透析研究所，上海 200032;
3. 上海市肾脏疾病与血液净化重点实验室，上海 200032
2. Kidney and Dialysis Institute of Shanghai, Shanghai 200032, China;
3. Kidney and Blood Purification Laboratory of Shanghai, Shanghai 200032, China
急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是一种由多种因素引起、以肾功能迅速下降为特征的临床综合征[1]。脓毒症是引起AKI的主要原因之一，尤其在重症监护室，超过50%的AKI由脓毒症引起[2]，且此类患者死亡率高达60%[3]。脓毒症AKI发病机制复杂，主要包括肾血流动力学改变、免疫细胞活化、促炎因子大量生成和内分泌失调等[4]。目前尚缺乏有效的防治措施。
法尼酯X受体（farnesoid X receptor，FXR）属于配体激活的核受体转录因子超家族，主要在肝、肠、肾和脂肪组织中表达[5]。近年来，FXR在胆汁代谢[6]、免疫调节、脂质代谢[7]等多方面的作用已被证实，尤其是FXR作为胆汁酸稳态的主要调节剂，在调节胆固醇、脂质和葡萄糖代谢中发挥重要作用。同时，越来越多的文献[8-9]表明FXR在调节免疫炎症反应的作用。FXR作为多种疾病的重要靶点，其在AKI中的作用鲜有报道。合成药物GW4064作为FXR的高亲和力激动剂，表现出较高的受体特异性和有效性[10]。本研究通过构建小鼠脓毒症AKI模型，观察脓毒症对肾脏FXR表达的影响，及FXR激活对脓毒症诱导的炎症反应和AKI的干预作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂采用6~8周龄C57BL/6雄性小鼠，体质量18~22 g，购自上海杰斯捷实验动物有限公司。DMEM/F12培养基和DMEM高糖培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂购于TaKaRa公司，Trizol购于美国Sigma-Aldrich公司，胶原酶Ⅳ购于美国Sigma-Aldrich公司，胰蛋白酶抑制剂、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松均购于索莱宝公司，percoll液购于Coolaber公司，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和GW4064购于美国Sigma-Aldrich公司，FXR抗体购于R & D和Biorbyt公司，β-actin抗体购于中杉金桥公司，肌酐检测试剂盒购于BioAssay Ststems公司。本研究引物由生工生物工程股份有限公司合成。
1.2 动物模型和实验分组小鼠随机分为4组：生理盐水（normal saline, NS）组、LPS组、LPS+溶剂对照组（dimethyl sulfoxide，DMSO）和LPS+FXR激动剂（GW4064）组，每组5~8只。LPS组小鼠腹腔注射LPS，剂量为10 mg/kg，NS组小鼠腹腔注射等量生理盐水，后2组分别在LPS注射前5 d始连续腹腔注射GW4064 30 mg/kg或DMSO。麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，取其肾脏组织进行后续实验。本研究通过复旦大学附属中山医院动物实验伦理审查委员会批准（2021-406）。
1.3 小鼠原代肾小管上皮细胞（primary tubular epithelial cells，PTECs）分离和提取颈椎脱臼6~8周龄C57野生型雄性小鼠，放至75%的乙醇中浸泡5 min，取出小鼠肾脏，放入4℃预冷的Hanks液中。在超净台中剥离肾包膜，Hanks液晃洗肾脏3~5遍，在5 mL灭菌EP管中将肾脏剪碎成1 mm3大小，将剪碎的肾脏组织放入5 mL细胞消化液（1.5 mg/mL胶原酶Ⅳ+1.5 mg/mL胰蛋白酶抑制剂）中，37℃，120 rpm消化1 h；加入FBS终止消化；过40 µm筛网，100×g，4℃离心3 min，弃上清液；适量Hanks液重悬后，100×g，4 ℃离心3 min，弃上清；适量DMEM/F12培养基重悬后，100×g，4℃离心3 min，弃上清；用5 mL DMEM/F12重悬沉淀，加入50% percoll液上方，14 000 r/min，4 ℃离心1 h；最上面一层为近端肾小管细胞，缓慢吸取最上层液体，1 000 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清；用含10%FBS的原代细胞培养液（DMEM/F12培养基+维生素C+氢化可的松+胰岛素+转铁蛋白）培养24 h后换液[11]。
1.4 细胞培养和处理取小鼠PTECs先于37℃、5%CO2的培养箱中培养3~4 d，待细胞扩增至60%~70%，随机分为4组：NS组、LPS组、LPS+溶剂对照组和LPS+GW4064组。LPS组细胞加入1 000 ng/mL LPS，培养24 h；NS组加入等量生理盐水；LPS+GW4064组以5 µmol/L GW4064[12]预处理细胞24 h，LPS+溶剂对照组给予等量DMSO后，加入1 µg/mL LPS继续培养24 h。
1.5 免疫组化染色小鼠肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，抗原修复，3%BSA室温封闭30 min，加入抗FXR抗体（1∶200，orb156973，Biorbyt公司）4℃孵育过夜，带有生物标记的二抗37℃孵育1 h，DAB显色，光镜下观察肾组织切片染色。
1.6 Western免疫印迹法提取小鼠PTECs蛋白后，经8%SDS-PAGE电泳，300 mA湿转90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入抗FXR抗体（1∶1 000，PP-A9033-00，R & D公司）4℃孵育过夜；β-actin抗体为内参（1∶1 000，TA-09，北京中杉金桥生物技术有限公司）。采用TBST洗膜3遍，每遍10 min，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3遍，每遍5 min，最后利用ECL显影。
1.7 RT-PCR检测小鼠肾组织或细胞内加入TRIzol，然后采用氯仿、异丙醇分离RNA，DEPC水配置的75%乙醇洗涤后，溶于DEPC水中，检测RNA浓度，以500 ng体系按照PrimeScript RT Master Mix试剂盒（TaKaRa公司，日本）说明进行逆转录，采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司，日本）进行PCR反应。采用β-actin作为内参。引物序列见表 1。
| 基因名称 | 方向 | 基因序列 |
| β-actin | F | AGCCATGTACGTAGCCATCC |
| R | GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA | |
| IL-6 | F | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC |
| R | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | |
| CCL2 | F | GCTACAAGAGGATCACCAGCAG |
| R | GTCTGGACCCATTCCTTCTTGG | |
| FXR | F | TGGGTACCAGGGAGAGACTG |
| R | CGGAAGAAACCTTTGCAGCC |
采用肌酐测定试剂盒（BioAssay Systems）配置标准液，吸取标准品和血清样本30 µL至96孔板中；A液和B液按1∶1配置肌酐测定工作液，每孔200 µL，510 nm测定0 min时的吸光度；37℃避光孵育5 min，再次测定5 min时的吸光度，根据标准品的浓度计算每个样品的浓度。
1.9 统计学处理采用GraphPad软件，正态分布的计量资料以x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，2组之间比较采用t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 LPS诱导小鼠肾脏炎症反应和AKI结果（图 1A）显示：与NS组相比，LPS组小鼠在LPS注射6 h后肾组织出现水肿，炎性细胞浸润；12 h后出现散在空泡变性；24 h后表现为广泛的空泡变性，并伴有散在肾小管上皮细胞坏死脱落。血清肌酐检测结果（图 1B）显示：LPS注射后12 h、24 h，LPS组小鼠血肌酐浓度明显高于NS组（P＜0.01）。通过RT-PCR检测肾组织匀浆中炎症因子和趋化因子表达水平（图 1C、1D）发现，LPS处理后6 h、12 h和24 h肾脏促炎细胞因子白细胞介素6（interleukin 6, IL-6）和趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）均明显上调（P＜0.01）。
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| 图 1 LPS诱导小鼠肾脏炎症反应和AKI A: 脓毒症小鼠肾脏H-E染色(×100)，黑色箭头为炎症细胞浸润，红色箭头为空泡变性，绿色箭头为肾小管上皮细胞脱落坏死；B: 血清肌酐水平；C: 肾脏IL-6 mRNA表达；D: 肾脏CCL2 mRNA表达。**P＜0.01与NS组相比。 |
LPS组和LPS+溶剂对照组小鼠肾脏病理H-E染色（图 2A）显示，2组小鼠均有肾间质水肿、明显的炎细胞浸润和肾小管上皮细胞变性，并有散在的细胞坏死，而LPS+GW4064组小鼠肾组织损伤明显减轻，仅表现为肾脏间质水肿和少量炎性细胞浸润。肾脏组织切片F4/80免疫组化染色（图 2B、2C）显示，与NS组比较，LPS组和LPS+溶剂对照组小鼠肾脏均有明显的巨噬细胞浸润；而与LPS组和LPS+溶剂对照组比较，LPS+GW4064组小鼠肾脏巨噬细胞浸润明显减少，血肌酐水平（图 2D）也显著下降（P＜0.05），肾组织匀浆中促炎因子IL-6（图 2E）和趋化因子CCL2（图 2F）表达明显下调（P＜0.05）。
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| 图 2 GW4064对小鼠脓毒症AKI和炎症反应的减轻作用 A: 肾脏病理H-E染色(×100)，黑色箭头为炎症细胞浸润，红色箭头为空泡变性，绿色箭头为肾小管上皮细胞脱落坏死；B：F4/80免疫组化染色，棕色提示阳性染色细胞；C：定量分析免疫组化染色阳性细胞（高倍镜视野，×100）；D: 血清肌酐水平；E: 肾脏IL-6 mRNA表达；F: 肾脏CCL2 mRNA表达。*P＜0.05与NS组相比, **P＜0.01与NS组相比，▽P＜0.05与LPS组相比，△P＜0.05与LPS+溶剂对照组相比。 |
肾组织切片免疫组化染色结果（图 3A）显示，FXR主要表达于正常肾小管上皮细胞胞核内，经LPS处理后FXR表达明显下调。检测LPS处理不同时间点小鼠肾脏FXR mRNA水平（图 3B）显示，LPS处理12 h后FXR表达水平明显下调（P＜0.05）。进一步分离PTECs，在体外检测LPS对上皮细胞FXR表达的影响，Western免疫印迹法和RT-PCR结果（图 3C、3D）均显示，与NS组相比，LPS 500 ng/mL和1 000 ng/mL处理PTECs后FXR蛋白和mRNA水平明显下调。
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| 图 3 LPS对小鼠肾脏和PTECs的FXR表达的抑制作用 A: 肾脏FXR免疫组化染色（×200），棕色染色提示FXR表达，黑色箭头为阳性染色细胞；B: LPS注射后不同时间肾脏FXR的表达；C: LPS对肾小管上皮细胞FXR蛋白表达的影响，Western免疫印迹法检测蛋白表达；D: LPS抑制PTECs的FXR mRNA表达。*P＜0.05与NS组相比, **P＜0.01与NS组相比。 |
利用RT-PCR检测PTECs促炎因子表达水平结果（图 4A）显示，与NS组相比，不同浓度的LPS处理PTECs后，炎症因子IL-6表达均显著上调（P＜0.01）。相较于NS组，1 000 ng/mL LPS处理PTECs趋化因子CCL2的mRNA水平也显著上调（P＜0.01），见图 4B。与LPS组和LPS+溶剂对照组相比，LPS+GW4064组炎症因子IL-6表达（图 4C）明显下调（P＜0.05）；趋化因子CCL2的生成（图 4D）也明显减少（P＜0.01）。
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| 图 4 FXR对LPS诱导的肾小管上皮细胞促炎因子的抑制作用 A: LPS诱导PTECs的IL-6 mRNA表达；B: LPS诱导PTECs的CCL2 mRNA表达；C: GW4064抑制LPS诱导的PTECs IL-6上调；D: GW4064抑制LPS诱导的PTECs的CCL2上调。*P＜0.05与NS组相比, **P＜0.01与NS组相比，▽P＜0.05与LPS组相比；△P＜0.05与LPS+溶剂对照组相比。 |
脓毒症AKI仍是危急重症领域的常见疾病，具有高发病率和高死亡率的特点。临床研究[13]发现，脓毒症患者合并AKI死亡率明显高于单纯脓毒症患者。炎症反应在脓毒症AKI发生中发挥重要作用，促炎因子IL-6作为机体免疫应答的重要介质，在脓毒症小鼠肾脏中显著上调[14]。脓毒症一方面诱导肾小管上皮细胞生成多种促炎因子[15]，另一方面，肾脏产生的趋化因子如CCL2可调节中性粒细胞和单核/巨噬细胞募集到肾组织[16]，引起炎细胞浸润并分泌促炎细胞因子，进一步加重炎症反应，促进AKI发生。而抑制促炎因子和趋化因子的生成，可减轻脓毒症引起的AKI。已有研究[17]证实，巨噬细胞在脓毒症诱导AKI发生中发挥重要作用。在小鼠脓毒症模型中，LPS引起巨噬细胞浸润肾脏组织，活化的巨噬细胞产生如TNF-α等多种炎症细胞因子，促进AKI发生。Gong等[18]研究证实，Fractalkine（CX3CL1）敲除可通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制巨噬细胞活化，减少多种炎症细胞因子的产生，减轻炎症反应。本研究结果显示，LPS诱导小鼠肾脏巨噬细胞浸润和炎症反应，而FXR激动剂GW4064可明显抑制肾脏巨噬细胞浸润。脓毒症AKI肾脏病理损伤除了炎症反应外，还可表现为细胞凋亡与非特异性改变，如肾小管上皮细胞空泡样变性、细胞肿胀和刷状缘消失等[19]。本研究发现，LPS促进肾脏和肾小管上皮细胞炎症因子IL-6和趋化因子CCL2表达增加，肾间质水肿、炎细胞浸润，细胞空泡样变性，肾小管坏死脱落，进而引起肾功能损伤。
FXR是核受体超家族成员，在肠肝循环调节和脂质稳态中发挥重要作用。既往FXR的研究主要集中在肝脏，在肝脏中参与调节代谢[20]，具有抗炎特性[21]。另外，FXR激活可减少肝脏促纤维化相关基因表达[22]。在中枢神经系统自身免疫性疾病中，FXR通过激活抗炎巨噬细胞，抑制T细胞介导的自身免疫，以IL-10依赖的方式抑制神经组织的炎症损伤[23]。在肾脏方面，Wang等[22, 24]研究证实FXR/TGR5双激动剂可抑制糖尿病肾病和肥胖相关肾病的进展；FXR与YAP之间交互作用可以抑制肾脏纤维化[25]。Kim等[26]研究表明，FXR通过调控细胞自噬和凋亡抑制AKI向慢性肾脏病的进展。本研究通过构建小鼠脓毒症体内外模型发现，LPS抑制肾脏和肾小管上皮细胞FXR表达；采用FXR激动剂（GW4064）可显著降低脓毒症小鼠血清肌酐浓度；FXR激活可显著抑制肾脏和PTECs炎症因子IL-6和趋化因子CCL2生成，减轻LPS诱导的肾脏炎症反应。
综上所述，本研究利用小鼠体内外模型证实FXR对LPS诱导AKI的保护作用，表明FXR激活可减少LPS诱导的肾小管上皮细胞促炎因子生成，减轻肾脏炎症反应和AKI，为临床防治脓毒症急性肾损伤提供新的思路和手段。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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