2022, Vol. 29
2. 复旦大学附属金山医院康复医学科, 上海 201508
2. Department of Rehabilitation, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China
维生素D是一种甾体类化合物，在人体正常生理过程中起重要作用，可以调节钙和磷酸盐代谢，维持骨骼健康[1]。维生素D又被称为免疫调节激素，在不同的非骨骼途径中发挥特殊作用，而血清25-羟维生素D水平低与多种免疫相关疾病的发生相关[2-3]。
Graves病（Graves’ disease，GD）是一种自身免疫性疾病，发病机制较复杂，细胞免疫和体液免疫均参与其中[4]。既往研究[5]证实，CD4+Th2细胞能诱导促甲状腺激素（TSH）受体结合抗体的产生，是导致GD发生发展的一个重要免疫因素。而Th17和Treg细胞是近年发现的CD4+Th细胞新亚型，Th17/Treg细胞比例失衡可导致免疫紊乱及免疫疾病的发生[6]。有研究[7]发现维生素D可抑制Th17细胞增殖，而甲状腺细胞核内存在维生素D受体，且GD患者存在较严重的维生素D缺乏[8]。因此，本研究探讨初发GD患者进行外周血1, 25-二羟维生素D干预后，Th17、Treg细胞占比及两者比值的变化，为临床GD的进一步诊治提供参考。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2020年1月至2020年12月复旦大学附属金山医院收治的新发GD患者30例，选择同期于我院进行健康体检且年龄、性别相匹配的健康者30例为对照组。纳入标准：（1）有甲状腺毒症临床表现；（2）血清游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺激素（FT4）升高，TSH下降；（3）甲状腺弥漫性肿大；（4）促甲状腺激素受体抗体（TRAb）阳性。排除标准：（1）年龄小于18岁或大于70岁；（2）伴有系统性结缔组织或其他自身免疫性疾病（如1型糖尿病、白癜风、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、强直性脊柱炎等）；（3）有肺部疾病、肝肾功能不全、冠心病等慢性疾病；（4）就诊前3个月内应用抗甲状腺药物、含维生素D的药物或保健品以及其他特殊药物（如胺碘酮、免疫抑制或调节药物）。本研究通过复旦大学附属金山医院伦理委员会批准（JIEC2021-S33），所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 临床观察指标采集所有的研究对象清晨空腹外周血，应用电化学发光免疫法测定FT4、FT3、TSH、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、TRAb和25-羟维生素D。
1.3 外周血单核细胞（PBMC）维生素D干预留取GD患者和对照组EDTA抗凝管的空腹外周血，制备PBMC。将每例GD患者PBMC分为2份：一份不予以维生素D干预（GD未干预组）；另一份PBMC中加入1, 25-二羟维生素D3（罗氏公司；10~(-7) mol/L[9-10]，100 μL）干预48 h（GD干预组）。对GD未干预组、干预后的GD干预组及对照组PBMC进行CD4+IL-17（Th17细胞）和CD4+Foxp3（Treg细胞）染色，采用Beckman Gallios流式细胞仪进行检测，采用Kaluza Analysis 2.1软件分析检测结果。
1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验或配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Tukey方法；非正态分布的计量资料以M(P25, P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以n(%)表示，采用Fisher确切概率法。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 一般资料分析结果（表 1）显示：GD组和对照组年龄、性别差异无统计学意义。GD组血清TSH明显低于对照组（P＜0.001），FT3、FT4、TPOAb、TRAb高于对照组（P＜0.001），TgAb与对照组差异无统计学意义。2组均存在维生素D不足（25-羟维生素D＜30 ng/mL），其中GD组更低，与对照组差异有统计学意义（P＝0.004）。
| 指标 | GD组（n＝30） | 对照组（n＝30） | t/z值 | P值 |
| 年龄/岁 | 40.30±10.50 | 37.47±8.12 | 1.17 | 0.247 |
| 男性n(%) | 11(36.67) | 8(26.67) | — | 0.580 |
| FT3/(pmol·L－1) | 20.79±8.23 | 4.29±0.54 | 10.96 | ＜0.001 |
| FT4/(pmol·L－1) | 58.72±24.36 | 17.47±1.92 | 9.25 | ＜0.001 |
| TSH/(mU·L－1) | ＜0.01 | 2.32±1.05 | －12.09 | ＜0.001 |
| TPOAb/(U·mL－1) | 65.51(15.21, 133.93） | 17.05(9.85, 24.73） | －3.81 | ＜0.001 |
| TgAb/(U·mL－1) | 99.61(13.00, 181.53） | 43.50(25.50, 66.00） | －1.07 | 0.287 |
| TRAb/(U·L－1) | 14.87(15.01, 19.45） | 0.70(0.41, 0.96） | －6.65 | ＜0.001 |
| 25-羟维生素D/(ng·mL－1) | 20.55±6.69 | 25.48±6.12 | －2.98 | 0.004 |
| FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4:游离甲状腺激素；TSH：促甲状腺激素；TPOAb: 甲状腺过氧化物酶抗体；TgAb: 甲状腺球蛋白抗体；TRAb：促甲状腺激素受体抗体。 | ||||
结果（表 2、图 1）显示：GD未干预组、GD干预组、对照组研究对象间外周血Th17细胞占比差异有统计学意义（F＝32.708，P＜0.001）。GD未干预组与干预组外周血Th17细胞占比均高于对照组（P＜0.001）；GD干预组与未干预组外周血Th17细胞占比差异无统计学意义（P＝0.515）。
| n＝30 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | 对照组 | GD未干预组 | GD干预组 | ||||||||||||||||||||||||||
| Th17/% | 0.054±0.017 | 0.299±0.191** | 0.263±0.176** | ||||||||||||||||||||||||||
| Treg/% | 0.037±0.017 | 0.029±0.013 | 0.040±0.019△△ | ||||||||||||||||||||||||||
| Th17/Treg | 1.64±0.67 | 14.97±8.90** | 8.08±5.37**△ | ||||||||||||||||||||||||||
| **P＜0.001与对照组比较；△P＜0.05，△△P＜0.001与未干预组比较。 | |||||||||||||||||||||||||||||
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| 图 1 流式细胞仪检测外周血CD4+IL-17（Th17细胞）占比 A：GD未干预组；B：GD干预组；C：对照组。 |
结果（表 2、图 2）显示：GD未干预组、GD干预组、对照组外周血Treg细胞占比差异有统计学意义（F＝4.050，P＝0.021）。GD干预组外周血Treg细胞占比较GD未干预组高（P＝0.019），两GD组与对照组外周血Treg细胞占比差异无统计学意义（GD未干预组：P＝0.125；GD干预组：P＝0.711）。
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| 图 2 流式细胞仪检测外周血CD4+Foxp3（Treg细胞）占比 A：GD未干预组；B：GD干预组；C：对照组。 |
结果（表 2）显示：GD未干预组、GD干预组、对照组外周血Th17/Treg细胞比值差异有统计学意义（F＝36.893，P＜0.001）。两GD组外周血Th17/Treg细胞失衡比值均高于对照组（P＜0.001）；GD干预组外周血Th17/Treg细胞比值较GD未干预组降低（P＜0.001）。
3 讨论维生素D是一种类固醇激素，在维持血清钙、磷水平方面起重要作用[11]。维生素D缺乏目前已成为一个全球性公共健康卫生问题，在健康人群中发生率很高[12]。本研究中健康人群也存在血清维生素D不足，而GD患者维生素D缺乏较健康者更明显（P＝0.004），与既往相关研究[13-15]结论一致。
维生素D参与细胞生长、分化和机体免疫功能的调节。研究[16]表明，甲状腺滤泡细胞中存在维生素D受体，1, 25-二羟维生素D与其结合后通过基因表达调控影响相应蛋白质的合成。1, 25-二羟维生素D在免疫系统中主要作用于抗原提呈细胞（APC）和T细胞，可直接作用于T细胞，抑制抗原特异性T细胞的增殖和细胞因子的产生[17]。目前多项研究[18-19]认为，Th17/Treg细胞失衡是GD发生、发展的重要作用机制之一。已有研究[20]发现，血清维生素D能使Th2细胞活性增强，并使Th1细胞活性减弱。近期有关非甲状腺自身免疫疾病的研究[7]发现，维生素D能通过抑制Th1/Th17细胞而增强Treg细胞的活性。而补充维生素D可以改善自身免疫性甲状腺疾病患者的甲状腺功能及相关抗体水平[21]。此外，国内最新研究[22]发现，在溃疡性结肠炎患者中，维生素D受体表达与Th17/Treg细胞失衡密切相关。
本研究通过流式细胞学分析发现，GD未干预组外周血Th17细胞占比较健康人明显升高（P＜0.001），虽然2组外周血Treg细胞占比差异无统计学意义，但Th17/Treg细胞比值差异明显（P＜0.001）。而加入1, 25-二羟维生素D后，外周血Treg细胞占比上调以及外周血Th17/Treg细胞比值明显下调（P＜0.05），与上述研究结论相符。
GD患者由于甲状腺激素水平升高，骨吸收加速、破骨细胞活性增强，常存在钙、磷负平衡，但多数患者发病早期血钙、磷水平正常[23]。本研究对象为新发GD患者，病程相对短，患者未接受血清钙、磷水平常规检测，因此，本研究未纳入血清钙、磷水平，这是本研究的局限性之一。本研究对照组PBMC未给予1, 25-二羟维生素D干预，后续须进行优化，以进一步探讨维生素D对Th17/Treg细胞的调节作用及免疫调节机制。此外，由于试验条件限制，本研究未分析临床治疗上补充维生素D后，患者体内Th17/Treg细胞的变化。
综上所述，本研究发现初发GD患者血清维生素D水平较健康人下降更明显，外周血Th17细胞明显增多，存在Th17/Treg细胞平衡破坏，而给予维生素D可改善初发GD患者外周血Treg细胞占比及调节Th17/Treg细胞失衡。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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