食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,包括食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。ESCC是中国最常见的食管癌组织类型。尽管治疗水平不断提高,但ESCC的5年生存率仍低于20%。目前认为ESCC发病的高危因素包括遗传因素、饮食因素和环境因素[1-2]。研究[3-4]表明,TP53、RB1和NOTCH1等基因在ESCC中发挥着重要作用。肿瘤的发生是一个多基因、多步骤的过程,所以本研究主要探讨是否有其他基因影响ESCC的预后。锌指蛋白24(ZNF24)也称为ZNF191或KOX17,在胚胎发育和成人组织中广泛表达[5-6]。研究[7-8]发现,敲除ZNF24会导致发育过程中胚胎的过早死亡,说明ZNF24在器官发育过程中起着重要作用。除了调节正常细胞的功能,ZNF24在癌症起始和进展的关键过程中发挥重要作用,如参与调控肝细胞癌和胃癌的增殖、分化、迁移和侵袭。然而,ZNF24在ESCC中的分子作用和临床意义尚不清楚。因此,本研究利用组织芯片采用免疫组织化学(IHC)法检测513例ESCC中ZNF24蛋白的表达,旨在探讨其表达与临床病理因素的关系及其对ESCC患者的预后预测价值。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2007年—2010年复旦大学附属中山医院胸外科手术切除的ESCC标本513例。所有患者术前未行放疗、化疗。H-E切片由两位病理医师独立确认ESCC诊断,临床病理参数:年龄,性别,肿瘤大小(以3 cm分为两组),肿瘤位置(食管上段、中段及下段),吸烟史,分化程度(高、中、低),浸润深度(Ⅰ:局限于黏膜下层、Ⅱ:侵犯肌层、Ⅲ:突破肌层),脉管及神经侵犯与否,淋巴结转移和临床分期(分Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳa两组)。本研究获复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(B2021-178R)。所有患者或家属均签署书面知情同意书。
1.2 组织芯片(TMA)的制备选取H-E切片中具有代表性的区域,从每例蜡块中取出宽2 mm、长6 mm的组织垂直放置于新的蜡块中,制作组织芯片,每个组织芯片包含70个病例。
1.3 IHC检测TMA取4 μm切片,脱蜡至水,抗原修复液(pH 9.0)中加热10 min。一抗为ZNF24(稀释比1∶50,Abcam公司),使用全自动免疫组化染色机Aliya进行免疫组化Compact Polymer法染色。
1.4 结果判读ZNF24染色阳性标准为细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒。TMA中ZNF24的表达情况由两位病理医师独立评估。IHC评分标准:无阳性染色为0分;弱染色为1分;弱到中度染色为2分;中度到强染色为3分。分别统计阳性细胞比例,计算H-score评分(强度×阳性细胞比例)。
1.5 随访513例患者的随访资料来自于病历记录、电话随访和家访。随访时间截至2018年12月。无病生存期(disease free survival, DFS)和总生存期(overall survival,OS)是从手术时间到首次复发时间(最后随访时间)或死亡时间计算。
1.6 统计学处理计数资料间的比较采用χ2检验及Fisher确切概率检验,Kaplan-Meier法进行生存分析,生存期间的比较采用Log-rank检验。使用Cox回归模型进行单因素和多因素生存分析。所有数据采用SPSS 22.0版本, 检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 临床病理特征513例(男性420例,女性93例)ESCC患者平均年龄为61.2岁(34~83岁)。201例有吸烟史。295例肿瘤直径小于3 cm,218例肿瘤直径大于3 cm。肿瘤位置以中下段为主。96.5%的病例为中、低分化。肿瘤的浸润深度多侵及肌层及外膜层。115例(22.4%)存在脉管癌栓,178例(34.7%)存在神经侵犯,239例(46.6%)出现淋巴结转移。依据第8版AJCC分期标准,281例(54.8%)为临床Ⅰ+Ⅱ期,232例(45.2%)为临床Ⅲ+Ⅳa期。513例ESCC患者中,5个临床病理参数与较差的预后具有明显相关性,分别为浸润深度(DFS,P < 0.001;OS,P < 0.001)、脉管侵犯(DFS,P=0.001;OS,P=0.001)、神经侵犯(DFS,P=0.001;OS,P=0.004)、淋巴结转移(DFS,P < 0.001;OS,P < 0.001)和临床分期(DFS,P < 0.001;OS,P < 0.001)。
2.2 ZNF24蛋白的表达及其与临床病理参数的相关性ZNF24蛋白阳性表达呈棕黄色或棕褐色,定位于细胞核(图 1)。为了选择最佳的界限值,本研究根据生存状态绘制受试者工作特征(ROC)曲线,确定以评分1.5为阈值,分为低表达组(135例,26.3%)和高表达组(378例,73.7%)。ZNF24表达与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化程度、浸润深度、脉管与神经侵犯与否、淋巴结转移和临床分期无明显相关性,但与肿瘤大小显著负相关(P < 0.001),和肿瘤位置显著正相关(P=0.038,表 1)。
临床病理参数 | ZNF24 | χ2 | R | P值 | |
低表达(< 1.5) | 高表达(≥1.5) | ||||
年龄/岁 | |||||
≤61 | 64 | 197 | 0.883 | -0.041 | 0.347 |
>61 | 71 | 181 | |||
性别 | |||||
男 | 114 | 306 | 0.817 | -0.040 | 0.366 |
女 | 21 | 72 | |||
肿瘤直径/cm | |||||
≤3 | 55 | 240 | 21.071 | -0.203 | < 0.001 |
>3 | 80 | 138 | |||
肿瘤部位 | |||||
上段 | 4 | 22 | 6.533 | 0.045 | 0.038 |
中段 | 74 | 156 | |||
下段 | 55 | 181 | |||
吸烟史 | |||||
无 | 82 | 230 | 0.000 | -0.001 | 0.983 |
有 | 53 | 148 | |||
分化程度 | |||||
Ⅰ | 7 | 11 | 1.853 | 0.048 | 0.396 |
Ⅱ | 77 | 210 | |||
Ⅲ | 51 | 157 | |||
浸润深度 | |||||
Ⅰ | 6 | 39 | 4.367 | -0.079 | 0.113 |
Ⅱ | 30 | 83 | |||
Ⅲ | 99 | 256 | |||
脉管侵犯 | |||||
无 | 108 | 290 | 0.615 | 0.035 | 0.433 |
有 | 27 | 88 | |||
神经侵犯 | |||||
无 | 91 | 244 | 0.358 | 0.026 | 0.549 |
有 | 44 | 134 | |||
淋巴结转移 | |||||
无 | 76 | 198 | 0.613 | 0.035 | 0.434 |
有 | 59 | 180 | |||
临床分期 | |||||
Ⅰ~Ⅱ | 77 | 204 | 0.378 | 0.027 | 0.539 |
Ⅲ~Ⅳa | 58 | 174 |
患者的中位随访时间为35个月(3~102个月),DFS和OS的5年生存率分别为68.6%和68.0%。DFS的平均随访时间和中位随访时间分别为41.2个月和30个月,OS的平均随访时间和中位随访时间分别为44.5个月和35个月。
ZNF24高表达组的DFS(P=0.524)和OS(P=0.527)均比ZNF24低表达组缩短,但差异无统计学意义。观察DFS和OS的生存曲线,分别于28个月及35个月后差异逐渐明显。进一步分析发现,当DFS大于28个月时,ZNF24高表达组生存期显著缩短(P=0.035);当OS大于35个月时,ZNF24高表达组生存期显著缩短(P=0.036,图 2)。
单因素生存分析发现,肿瘤浸润深度、脉管及神经侵犯、淋巴结转移和临床分期与DFS(表 2)和OS(表 3)相关;多因素生存分析发现,浸润深度和淋巴结转移是患者独立预后因子,ZNF24蛋白高表达并不是ESCC的独立预后因子。
临床病理参数 | 单因素分析 | 多因素分析 | |||
P值 | HR | P值 | HR | ||
年龄(>61岁vs≤61岁) | 0.203 | 1.165(0.921~1.473) | |||
性别(女vs男) | 0.188 | 1.230(0.904~1.674) | |||
肿瘤直径(>3 cm vs ≤3 cm) | 0.187 | 1.173(0.926~1.486) | |||
肿瘤部位 | 0.972 | ||||
中段vs上段 | 0.814 | 0.938(0.549~1.601) | |||
下段vs上段 | 0.838 | 0.945(0.554~1.614) | |||
吸烟 | 0.375 | 1.114(0.878~1.415) | |||
分化程度 | 0.112 | ||||
Ⅱ vs Ⅰ | 0.470 | 1.323(0.620~2.824) | |||
Ⅲ vs Ⅰ | 0.195 | 1.654(0.773~3.542) | |||
浸润深度 | < 0.001 | 1.676(1.352~2.078) | 0.001 | 1.463(1.175~1.821) | |
脉管侵犯 | 0.001 | 1.559(1.205~2.017) | 0.570 | 1.081(0.826~1.415) | |
神经侵犯 | 0.005 | 1.408(1.108~1.790) | 0.834 | 1.028(0.795~1.329) | |
淋巴结转移 | < 0.001 | 2.725(2.136~3.476) | < 0.001 | 2.490(1.945~3.187) | |
临床分期(Ⅲ~Ⅳa vs Ⅰ~Ⅱ) | < 0.001 | 2.739(2.150~3.488) | 0.976 | 0.984(0.341~2.841) | |
ZNF24表达(低vs高) | 0.531 | 1.092(0.830~1.437) |
临床病理参数 | 单因素分析 | 多因素分析 | |||
P值 | HR | P值 | HR | ||
年龄(>61岁vs≤61岁) | 0.219 | 1.161(0.915~1.475) | |||
性别(女性vs男性) | 0.114 | 1.295(0.940~1.784) | |||
肿瘤直径(>3 cm vs ≤3 cm) | 0.140 | 1.198(0.942~1.524) | |||
肿瘤部位 | 0.899 | ||||
中段vs上段 | 0.981 | 1.007(0.580~1.749) | |||
下段vs上段 | 0.658 | 0.945(0.737~1.213) | |||
吸烟 | 0.271 | 1.146(0.899~1.460) | |||
分化程度 | 0.230 | ||||
Ⅱ vs Ⅰ | 0.287 | 0.661(0.308~1.416) | |||
Ⅲ vs Ⅰ | 0.135 | 0.831(0.652~1.059) | |||
浸润深度 | < 0.001 | 1.808(1.439~2.271) | < 0.001 | 3.576(1.756~7.283) | |
脉管侵犯 | 0.002 | 1.528(1.173~1.990) | 0.669 | 1.063(0.804~1.404) | |
神经侵犯 | 0.001 | 1.499(1.174~1.912) | 0.460 | 1.104(0.849~1.435) | |
淋巴结转移 | < 0.001 | 2.767(2.160~3.545) | < 0.001 | 2.492(1.938~3.204) | |
临床分期(Ⅲ~Ⅳa vs Ⅰ~Ⅱ) | < 0.001 | 0.361(0.282~0.462) | 0.418 | 0.638(0.215~1.895) | |
ZNF24 (低表达vs高表达) | 0.532 | 1.093(0.827~1.445) |
ZNF24是类Kruppel锌指基因家族的一员,其N端含有1个SCAN结构域,SCAN结构域由富含亮氨酸区域组成高度保守的模体,用来调节与其他含有SCAN结构域的蛋白质之间相互作用[9]。ZNF24被认为是一种调控细胞生长、分化和发育的蛋白质[10],参与胚胎发育[7]和造血[11],并被证明在癌症的发生发展过程中发挥重要作用[12]。
ZNF24在不同的恶性肿瘤中有着完全不同的表达模式和肿瘤相关作用。在肝细胞癌中,ZNF24的表达高于正常肝组织,可直接与β-catenin启动子结合促进细胞增殖[13]。ZNF24还可增加WNT8B启动子在肝细胞癌中的转录活性,从而上调WNT8B的转录和蛋白表达,进而通过Wnt信号通路促进肿瘤细胞增殖[14]。尽管ZNF24有促增殖的作用,但能够抑制肝细胞癌的转移[15]。在三阴性乳腺癌中,ZNF24表达上调,microRNA-940通过直接靶向ZNF24,在细胞增殖和迁移中起肿瘤抑制作用[16]。Jia等[17]发现,ZNF24通过直接结合VEGF近端启动子,作为肿瘤血管生成的负调控因子,从而抑制VEGF转录。ZNF24的异常表达同时也在胶质母细胞瘤中被发现,并显示出预后预判意义[18]。
然而,ZNF24在ESCC中的作用仍不清楚。本研究发现ZNF24在513例ESCC中蛋白过表达,阳性率为73.7%。这与ZNF24在前列腺癌组织和细胞系中均过表达的结果一致[6]。ZNF24位于染色体18q12.1,在直肠癌中该区域经常缺失,提示ZNF24在肿瘤生长中可能起负调控作用[19-20]。本研究还发现,ZNF24蛋白高表达与ESCC的肿瘤大小具有显著的负相关性。
同时,本研究发现ZNF24高表达的患者有预后较差的趋势(DFS,P=0.524;OS,P=0.527),尤其是当DFS大于28个月时,ZNF24高表达患者生存期显著缩短(P=0.035)。当OS大于35个月时,ZNF24高表达患者生存期也显著缩短(P=0.036),该结果提示ZNF24可能是ESCC预后不良的重要参考指标。这表明ESCC中ZNF24基因表达的调控途径可能与肝癌不同。笔者猜想,ZNF24在肿瘤手术切除后,或在不同的微环境下,基因的表达不同,ZNF24在恶性肿瘤中的双重作用可能与其多个锌指区域相关。人群、检测方法及临界值的差异也是潜在的原因。这些结果表明,ZNF24在不同的组织中扮演着不同的角色,可能是ESCC的药物靶点之一。
本研究首次报道了ZNF24与ESCC的预后关系,但主要侧重于阐明其临床意义,并未在分子水平上充分探讨其作用机制,进一步研究其信号通路将为一种新的药物靶点提供可能。本研究表明ZNF24在ESCC中蛋白过表达,高表达的患者DFS和OS预后均较差,尤其是当DFS大于28个月和OS大于35个月时,ZNF24是ESCC预后不良的重要参考指标。
利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突。
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