2022, Vol. 29
乳腺癌是全球发病率最高的肿瘤之一，占女性新发癌症总数的24.5%[1]。乳腺癌的发生发展与激素、肥胖、遗传等多种因素有关。环磷腺苷效应元件结合蛋白1（cAMP-response element binding protein 1, CREB1）是亮氨酸拉链转录因子CREB/ATF家族的一员，可被多种蛋白激酶磷酸化，进而调控靶基因的转录过程[2-3]。CREB1与肺癌[4]、肾癌[5]和胶质瘤[6]的发生发展有关，但CREB1对乳腺癌细胞生物学行为的影响鲜见报道。
本研究通过构建CREB1表达沉默的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，采用Western印迹、CCK-8实验、集落形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察CREB1对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，旨在为乳腺癌的诊疗提供新的潜在靶点。
1 材料与方法 1.1 细胞系、主要试剂和仪器人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和人肾上皮细胞系HEK293T购于美国模式菌种收集中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司（16140063、11995065、15090046）；磷酸盐缓冲液（PBS）购于美国Hyclone公司（SH30256.01B）。携带短发夹RNA（shRNA）序列的pLKO.1载体购自美国Sigma公司。Lipo3000试剂购于美国Invitrogen公司（L3000015）；NP-40裂解液、细胞周期与细胞凋亡流式检测试剂盒购于海门碧云天生物技术研究所（P0013F、C1052）；BCA蛋白定量试剂盒购于美国Thermo公司（23227）。CREB1、GAPDH、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购于美国CST公司（9197、5174、55506、18048、12790、13331、7074）；CCK-8试剂盒、Caspase 3、Bcl-2、Survivin、Bax一抗购于英国Abcam公司（ab228554、ab32351、ab32124、ab76424、ab32503）。ECL Western印迹试剂盒购于南京诺唯赞医疗科技有限公司（E412-01）；Transwell小室和BD Matrigel基质胶购自北京明阳科华生物科技有限公司（353097、354480）。酶标仪和流式细胞仪购自上海伯乐生命医学产品有限公司。
1.2 细胞培养及分组MCF-7和MDA-MB-231细胞系用含10%FBS和100 U/mL青链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。将细胞分为shSCR组（空载质粒）、shCREB1#1组和shCREB1#2组。
1.3 载体构建及慢病毒转染用Lipo3000将shRNA-pLKO.1质粒转染至HEK293T细胞，用慢病毒感染HEK293T细胞后，收集病毒液，转染MCF-7和MDA-MB-231细胞。用嘌呤霉素筛选7 d后，获得稳定沉默CREB1的乳腺癌细胞系。shRNA的序列见表 1。
| shRNA | 序列 |
| shCREB1#1 | 5'-GCTCGATAAATCTAACAGTTA-3' |
| shCREB1#2 | 5'-GCCTGAAAGCAACTACAGAAT-3' |
| shSCR | 5'-GCTCCGTGAACGGCCACGAGT-3' |
Western印迹：使用NP-40裂解液提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成后，将蛋白转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗孵育，4℃摇床过夜；第2天回收，经TBST洗膜后，于室温下用二抗孵育1 h，用ECL试剂盒检测蛋白条带。
RT-PCR：CREB1及GAPDH的PCR引物如表 2所示。配置20 μL反应体系，设定两步法RT-PCR程序，每个组设置3个副孔；读取样本光密度（D）值。
| 基因 | 引物序列 | |
| GAPDH | 上游 | 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3' |
| 下游 | 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3' | |
| CREB1 | 上游 | 5'-ATCTTCTGATGCACCAGGAGTG-3' |
| 下游 | 5'-AATTGGAGTTGGCACCGTTA-3' |
取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，以100 mL/孔接种于96孔板中，使每孔含细胞3 000~5000。每个细胞系设置够5 d测量的副孔，将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，分别于培养1、2、3、4、5 d后弃去3个副孔中的培养基，加入10 μL CCK-8溶液，于培养箱中孵育2 h后，测定450 nm处的D值。
1.6 集落形成实验取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，用细胞板对细胞进行计数。将计数好的细胞以600个/孔接种于6孔板并使细胞分散均匀，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周。待孔板中形成肉眼可见的克隆时，弃上清液，用PBS清洗，阴干，甲醇固定。加适量结晶紫染色20 min，统计细胞的克隆数。
1.7 流式细胞术检测细胞周期将细胞以2×105个/孔接种至6孔板，于培养箱中培养过夜。取对数生长期的细胞，消化并收集，4℃下200×g离心5 min，收集细胞悬液。用70%冷乙醇固定细胞18 h，用PBS洗涤2次。每个试管加入500 μL PI/RNase染液，混匀，室温下避光孵育20 min后置于冰上，并于1 h内通过流式细胞仪检测细胞周期。
1.8 流式细胞术检测细胞凋亡铺板、制备单细胞悬液过程同上。用冰PBS洗涤细胞2次后，将细胞转移到流式管中，离心，弃上清。加入300 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混匀，避光，室温孵育15 min。上机前5 min加入5 μL的PI染色，并补加200 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer。根据Annexin Ⅴ和PI的染色情况筛选出凋亡细胞。
1.9 Western印迹检测细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白采用Western印迹检测CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Bcl-2、Survivin、Caspase 3、Bax蛋白的表达情况，以GAPDH为内参。实验步骤同上。
1.10 细胞划痕实验检测细胞迁移能力用马克笔在六孔板背后划线，每隔1 cm划一道，每孔至少有5条线穿过。每孔铺约5×105个细胞，每组设置3个副孔，培养过夜。用移液枪头在六孔板内按照马克笔标记垂直划线，用PBS洗涤细胞后，加入无血清培养基。将六孔板放入培养箱中培养，于8 h、24 h后拍照并计算划痕闭合率。
1.11 Transwell细胞迁移和侵袭实验进行迁移实验前，先用无血清培养基饥饿细胞12 h，制备单细胞悬液。在Transwell小室上层加入300 μL无血清培养基，在培养箱中孵育2 h。在上层小室中加入100 μL细胞悬液，在下层小室中加入600 μL含10%FBS的培养基，每组设置3个复孔。将Transwell小室放入培养箱培养16 h后取出，用5%戊二醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察、拍照，并对细胞进行计数。侵袭实验除须在接种细胞前将BD Matrigel基质胶置于上层小室并培养24 h外，余步骤同迁移实验。
1.12 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism绘制统计图。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 CREB1表达沉默细胞株的鉴定结果（图 1）显示，shRNA干扰后，shCREB1#1组和shCREB1#2组中MCF-7和MDA-MB-231细胞系CREB1的mRNA和蛋白水平均低于shSCR组（P < 0.001），提示CREB1沉默细胞株构建成功。
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| 图 1 RT-PCR和Western印迹检测MCF-7和MDA-MB-231细胞系中CREB1的表达 A、C：MCF-7细胞系；B、D：MDA-MB-231细胞系。n=3, x±s；***P < 0.001。 |
CCK-8实验结果（图 2A）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖能力均明显减弱（P < 0.001）。集落形成实验结果（图 2B、2C）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的克隆数减少（P < 0.001）。
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| 图 2 沉默CREB1对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和集落形成的影响 A：CCK-8法检测细胞增殖能力；B、C：集落形成实验检测细胞的克隆数。n=3, x±s；***P < 0.001。 |
流式细胞分析结果（图 3A）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的G1期细胞占比增多，而S期细胞占比减少（P < 0.05）。同时，Western印迹结果（图 3B）显示，沉默CREB1后，MCF-7细胞中CDK2、CDK4和CDK6的表达量降低，MDA-MB-231细胞中CDK2、CDK4、CDK6和Cyclin D1的表达量降低。
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| 图 3 沉默CREB1对MCF-7和MDA-MB-231细胞细胞周期的影响 A：流式细胞术检测各组细胞G1期、S期、G2期细胞占比；B：Western印迹检测细胞周期相关蛋白的表达水平。n=3, x±s; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
流式细胞分析结果（图 4A）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的凋亡率升高（P < 0.05）。Western印迹结果（图 4B）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表达水平降低（P < 0.05），其中以shCREB1#2组的凋亡相关蛋白表达变化更明显。
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| 图 4 沉默CREB1对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响 A：流式细胞术检测细胞凋亡率；B：Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。n=3, x±s; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
结果（图 5）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞划痕8 h和24 h后的愈合率降低（P < 0.05）。
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| 图 5 沉默CREB1对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 n=3, x±s; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
结果（图 6）显示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭数量均减少（P < 0.05）。
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| 图 6 沉默CREB1对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响 A、B：Transwell迁移实验；C、D：Transwell侵袭实验。Original magnification: ×200。n=3, x±s; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
CREB1于1987年首先由Montrminy等从大鼠脑组织中分离纯化出来[7-8]。近年来，CREB1在肿瘤发生发展中的作用越来越受到关注。CREB1作为重要的转录因子，可以与多种靶基因的启动子结合，从而调控基因的表达，包括CDK4、Cyclin D1和Cyclin A等细胞周期关键蛋白[9]。在胶质瘤中，CREB1可通过激活PI3K/Akt和MAPK信号通路促进Cyclin D1、Bcl-2的表达，而促进胶质瘤细胞的增殖并抑制凋亡[10-11]。过表达CREB1可抵抗miR-133a-3p对视网膜母细胞瘤的促凋亡作用[12]。
本研究中，沉默CREB1可导致乳腺癌细胞的增殖能力减弱，G1/S期阻滞以及CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1表达水平下降，提示CREB1可能在乳腺癌细胞的增殖过程中起关键作用。而且，沉默CREB1还引起乳腺癌细胞的凋亡增加，凋亡蛋白Caspase 3、Bax的表达水平升高而促生存因子Bcl-2、Survivin的表达水平降低，表明CREB1可能参与乳腺癌细胞凋亡信号的调控。尽管本研究Western印迹结果中MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达的变化与MDA-MB-231细胞并不完全一致，但与沉默CREB1抑制乳腺癌细胞周期和促进其凋亡的结论一致。关于CREB1调控乳腺癌增殖和凋亡过程的分子机制尚待进一步研究。
肿瘤细胞迁移是一个复杂的、多因素调控的过程。该过程除受外部因素影响外，还与肿瘤细胞基因表达有关[13-15]。细胞迁移和侵袭的发生与细胞间黏附减少和细胞外基质降解密切相关。E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-CAD）在上皮细胞胞间连接中起重要作用，当E-CAD缺乏时，上皮细胞会具有间充质细胞的特性，其流动性大幅增强[16]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族是与肿瘤转移密切相关，可以降解多种细胞外基质中的蛋白质，促进肿瘤细胞转移[17]。本研究细胞划痕实验和Transwell实验发现，沉默CREB1可导致乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力减弱，表明CREB1与乳腺癌细胞的转移有关。但本研究未进一步测定E-CAD和MMPs等蛋白的表达水平，后续可通过Western印迹、RT-PCR、ELISA等方法测定相关蛋白的表达水平，并对迁移和侵袭的相关信号通路进行探索。
目前有关CREB1与乳腺癌关系的研究多侧重于CREB1作为中介因子对其他肿瘤相关蛋白的调节作用[18-19]，而CREB1调控的下游靶基因众多，这些靶基因对乳腺癌生物学行为的影响仍需进行研究。本研究通过沉默CREB1基因，抑制了CREB1调节相关基因转录的“总闸门”作用，证明CREB1表达的降低可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并诱导细胞凋亡，为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。未来可补充体内实验，在动物模型中对细胞实验结果进行进一步验证。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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