2. 海军军医大学第二附属医院麻醉科,上海 200003;
3. 河北北方学院附属第一医院,张家口 075000
2. Department of Anaesthesiology, Changzheng Hospital, the Second Affiliated Hospital of Naval Medical University, Shanghai 200003, China;
3. The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei, China
铜绿假单胞菌是一种条件性致病菌,也是院内获得性肺炎(hospital acquired pneumonia,HAP)的主要病原菌[1-2]。铜绿假单胞菌引发的感染多发生在免疫力低下,皮肤黏膜受损或是ICU长期体内留置气管导管和导尿管等患者人群中[3-4]。近年来,随着抗生素的广泛使用,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的数量与日俱增,越发影响着人们的健康和生活[5]。根据一项2013—2018年在美国进行的回顾性队列研究[6],23 331例复杂尿路感染住院患者中,铜绿假单胞菌感染占三重(包括氟喹诺酮、第三代头孢菌素、磷霉素、呋喃妥因和甲氧苄啶-磺胺甲唑中3种以上)耐药感染的8.03%,仅次于大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌和变形杆菌。根据2018版中国成人医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)的诊治指南[7],铜绿假单胞菌感染占HAP的18.7%~20.0%,占VAP的12.5%~27.5%,仅次于鲍曼不动杆菌感染,并且老年患者中更多见。并且铜绿假单胞菌还可依据生存环境的不同转化成不同的生存方式。铜绿假单胞菌可在免疫受损的宿主中引起侵袭性感染,例如急性肺炎或血液感染。但是在另外一些情况下,铜绿假单胞菌还会导致持续的慢性感染,例如患有遗传性疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)的患者,铜绿假单胞菌以生物膜的形式抵抗宿主的清除作用[8]。预防铜绿假单胞菌的感染对于减缓CF疾病的进展至关重要。
杂交瘤技术是在体细胞融合技术基础上发展起来的,将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合,形成能分泌针对抗原的高特异性抗体——单克隆抗体(单抗),在临床上具有良好的治疗效果[9]。单抗的问世及人鼠嵌合型甚至全人源抗体的出现,消除了鼠源抗体Fc导致的不良反应,为抗感染治疗增加了新的方法[10-11]。最近一项关于来自康复期COVID-19患者的人单抗对SARS-CoV-2感染的治疗研究[12]中,人单抗避免了发生抗体依赖性疾病加重(antibody-dependent enhancement,ADE)的风险。
缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system,T6SS)的一种结构性蛋白,多在其尖端连接特异性的效应因子,并将其递送到原核或真核细胞内[13]。因铜绿假单胞菌含有不同功能的效应子,所以相应地也存在可以互相匹配的不同的VgrGs[14]。部分VgrG进化出了脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸(proline-alanine-alanine-arginine,PAAR)功能结构域,产生内化上皮细胞的作用[15-16]。本研究中涉及的是经典的VgrG1a蛋白,只发挥传送毒素的作用,目前尚未发现此蛋白的其他生物学功能。铜绿假单胞菌通过T6SS的VgrG1a分泌一种针对靶细胞能量的氧化型辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ NAD(P)+,抑制原核生物生长和代谢[17]。本实验通过原核系统表达VgrG1a蛋白,免疫小鼠制备出鼠源和人源化的单抗,为深入探讨VgrG1a蛋白在铜绿假单胞菌T6SS相关感染的功能起到了铺垫作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物、细胞和菌株从北京擎科生物科技有限公司购买Escherichia coli BL21(DE3)plysS;5%兔血红细胞购自森贝伽生物科技有限公司;Expi293细胞购自Thermo公司;从上海斯莱克有限公司购买6~8周龄的BABL/c小鼠;骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653购自中科院细胞库。
1.2 重组质粒的构建和转化从NCBI网站上查找关于VgrG1a的序列信息,并将序列插入到pET-21a质粒中(添加6×His标签和Amp抗性以备纯化和筛选用)送公司合成,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,筛选阳性单菌落,即为成功表达目的蛋白VgrG1a的菌株。
1.3 VgrG1a重组蛋白的诱导表达、纯化和透析置换将表达VgrG1a的大肠杆菌在Luria-Bertani(LB)+氨苄西林(ampicillin简写为Amp,1∶1 000稀释)培养板上活化两代后,挑单菌落到无菌LB+Amp(1∶1 000稀释)的液体培养基中,37℃摇床200 r/min培养至对数生长期,测600 nm处光密度为0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂(0.5 mmol/L)。将温度降至16℃继续培养16 h后,离心收集菌液沉淀。
菌液于0℃超声至透亮(10 mm探头,每超声3 s暂停3 s,共破碎至少100次),13 000 r/min离心30 min分别收集上清和菌沉淀,沉淀用无菌PBS稀释后准备SDS-PAGE分析,上清则用0.22 μm滤头过滤后与镍柱混悬30 min充分结合。在填料柱中洗脱,杂蛋白用0.5×Binding Dilution(简称为BD)液去除至蛋白显色液不变蓝,目的蛋白用1×Binding Buffer(简称为BB)液洗脱至显色液无色。将收集的目的蛋白液装入透析袋,用含25 mmol/L HEPES(pH 8.0)的透析液置换溶剂中的咪唑,每2 h换1次透析液直至透析干净。将目的蛋白定量测浓度后低温保存。
1.4 VgrG1a重组蛋白的鉴定和检测少量上清、无菌PBS稀释后的沉淀和透析后的目的蛋白分别加入DTT和5×Loading Buffer制成样品,煮沸后准备SDS-PAGE用。样品在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳至条带分离清晰后,用考马斯亮蓝染色,去离子水洗净拍照。
将VgrG1a重组蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶上后120 V恒压电泳120 min后,300 mA恒流转膜。用TBST(Tris buffered saline Tween)缓冲液封闭后洗净,再转移到含多聚组氨酸标签(His-tag)抗体的小鼠一抗稀释液浸泡过夜。洗净一抗后,用山羊抗小鼠IgG二抗37℃结合1 h,最后用反应液显色。
1.5 VgrG1a重组蛋白的酶联免疫吸附实验将VgrG1a蛋白浓度稀释至1 μg/mL置于96孔酶标板中4℃过夜。用含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。再用5%牛血清白蛋白(BSA)于37℃封闭1 h后再次洗板,加入相应抗体(2 μg/mL)4℃过夜培养。用PBS清洗干净后用山羊抗小鼠IgG抗体(2 μg/mL,1:10 000稀释)在37℃孵箱结合1 h后,再次清洗干净,在四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色后加入2N硫酸溶液终止反应,测450 nm处光密度值。
1.6 抗VgrG1a蛋白鼠源单抗的制备和筛选参考冷泉港免疫法免疫。分别在BALB/c小鼠腹股沟、尾根、颈背部皮下和腹腔注射混有弗氏佐剂(首次用完全型,其余用不完全型)的25 μg目的蛋白混悬液。每隔2周免疫,共免疫3次后尾静脉加强免疫1次。除首次免疫蛋白量为25 μg外,其余均为12.5 μg。第5周小鼠尾尖采血200 μL,取血清进行ELISA检测。
将免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞按照4∶1比例在聚乙二醇(PEG)的作用下进行融合,并用含10%血清的培养基终止反应。300×g室温离心弃上清后,再用含20%血清培养基重悬融合细胞,调整密度为每孔1×105个细胞培养。融合第2天补充含HAT(H:Hypoxanthine次黄嘌呤,A:Aminopterin氨基蝶呤;T:Thymidine胸腺嘧啶核苷)的选择培养基。第10天更换为含HT的筛选培养基。在融合2周后,未融合细胞消失,根据细胞生长情况检测上清中特异性抗体与VgrG1a蛋白的亲和力。采用有限稀释法将杂交瘤细胞稀释到约每孔1个细胞后,在96孔板中培养,挑选单克隆细胞检测上清中特异性抗体与VgrG1a蛋白的亲和力。
1.7 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型单抗的制备将筛选出的鼠源单抗测序后,设计成质粒转化大肠杆菌。提取出完整质粒,转化Expi293细胞。37℃摇床培养48 h后收集含抗体的上清,用Protein A磁珠进行纯化。
用含0.1%吐温的Washing Buffer洗杂蛋白直至蛋白显色液不变蓝。用含0.05 mol/L柠檬酸的Elution Buffer洗脱目的蛋白(加入适量1 mol/LTris HCl中和)直至蛋白显色液不变蓝。然后用PBS(pH 7.2)缓冲液,2 800×g离心5 min置换洗脱液。使用过后的Protein A用0.1 mol/L NaOH去除蛋白后,乙醇重悬,4℃保存。
1.8 统计学处理结果用x±s表示,关于VgrG1a重组蛋白与His标签抗体亲和力的ELISA检验,用多因素方差进行分析,并用Tukey法进行多重比较。检验水准(α)为0.05。ELISA结果均使用GraphPad Prism7.0软件进行数据分析并绘制拟合曲线。
2 结果 2.1 VgrG1a基因表达质粒的构建、重组蛋白的诱导表达及纯化后鉴定在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索得到铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的序列信息,合成得到质粒pET21a-VgrG1a。VgrG1a蛋白的相对分子质量约为72 000。将pET21a-VgrG1a质粒转化大肠杆菌,待含pET21a-VgrG1a质粒的菌液D600达到0.6~0.8后,添加0.5 mmol/L IPTG,在摇床中200 r/min震荡培养,观察上清,菌沉淀和纯化的蛋白中相对分子量72 000处目的蛋白含量的变化。对比菌液在37℃摇床中200 r/min培养6 h的结果(图 1 A),发现最佳诱导条件为待菌液D600达到0.6~0.8后,添加0.5 mmol/L IPTG,在16℃摇床中200 r/min培养16 h(图 1B)。
在16℃诱导表达的蛋白,在通过0.5倍BD洗脱液去除杂蛋白后,相对分子质量72 000处条带较明显且含量较高,相对分子质量25 000处条带可能为目的蛋白的降解成分(图 2 A)。同样经Western印迹确认各条带都含有His标签,推测VgrG1a重组蛋白易降解(图 2 B)。
为检测VgrG1a重组蛋白是否含有6×His标签的目的蛋白,分别将VgrG1a蛋白和带有6×His标签的金黄色葡萄球菌α溶血素蛋白包被同一块96孔酶标板(来自本课题组的金黄色葡萄球菌α溶血素为阳性对照,BSA溶液为阴性对照)。分别与抗6×His抗体溶液、小鼠IgG抗体溶液和PBS溶液过夜培养检测其亲和力(图 2 C)。并通过方差分析,检验得出VgrG1a重组蛋白与6×His抗体稀释液为特异性结合,即纯化后的VgrG1a重组蛋白为目的蛋白。
2.2 VgrG1a蛋白免疫后小鼠血清抗体效价的检测在用原核系统表达的VgrG1a蛋白免疫BALB/c小鼠5周后,将小鼠血清中抗体与抗原VgrG1a结合测得不同小鼠间的免疫差异(图 3)。5只小鼠编号分别为A、A34、A65、A85和A100(已排除在免疫过程中死亡的1只)。观察在1∶640 000处稀释倍数时,编号为A85、A65和A的小鼠血清中抗体的亲和力仍较高,提示为免疫成功。
2.3 抗VgrG1a蛋白的鼠源单抗的制备和筛选分别在96孔板和24孔板中进行ELISA筛选,同一种孔板筛选2次,共4次(图 4 A、4 C)。经筛选从1 040株杂交瘤细胞中筛选出91个细胞,再将这91个细胞从96孔板转移到24孔板中继续培养,取上清测亲和力,最后选出12个长势较好且亲和力较高的细胞株进行亚克隆,并挑选出4个生长良好且为单克隆的细胞3D2C9、6D9E10、6G2D9和8A4F5(图 4 B、4 D)。
2.4 抗VgrG1a蛋白的鼠源抗体的SDS-PAGE检测和ELISA亲和力比较将4种抗体(3D2C9、8A4F5、6G2D9和2G5F10)分别进行SDS-PAGE电泳分析,其中3D2C9、6G2D9和2G5F10在相对分子质量为55 000处有1条明显的重链,在相对分子质量约为30 000左右有2条轻链,推测可能为轻链糖基化修饰后形成了2条带。8A4F5抗体在相对分子质量约为30 000处有1条明显的轻链,在相对分子质量为55 000左右有1条较粗的重链,推测可能为重链被修饰后的结果(图 5A)。通过非还原电泳分析后,4种抗体在大于相对分子质量为130 000处均为一条明显条带,提示抗体结构完整(图 5 B)。
再分别将4种蛋白[VgrG1a、铜绿假单胞菌V抗原(PcrV)、金黄色葡萄球菌γ-溶血素A(HlgA)、金黄色葡萄球菌α-溶血素突变毒素(H35L)]包被在同一块96孔酶标板上,通过对比4种抗体与其他蛋白的亲和力,检测抗体对于VgrG1a蛋白的特异性亲和力。PcrV、HlgA、H35L均为本实验室自行制备的蛋白。经验证,除3D2C9外,其余3种抗体2G5F10、6G2D9和8A4F5均与VgrG1a蛋白特异性结合(图 6)。将抗体送公司测序得到抗体重链和轻链的氨基酸序列信息,因8A4F5抗体与VgrG1a的亲和力较高且测序结果显示为单克隆,所以选择8A4F5抗体进行人源化(2G5F10、6G2D9和8A4F5的平衡解离常数分别为2.024×10-10、2.935×10-10和1.696×10-10 mol/L)。
2.5 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型单抗的制备及鼠源单抗和人鼠嵌合型单抗的比较用Expi293细胞表达人鼠嵌合型单抗8A4F5后,SDS-PAGE显示出分布清晰2条带:相对分子质量为55 000处为重链,相对分子质量为30 000处为轻链(图 7 A)。在同一块96孔板分别检测人鼠嵌合型和鼠源性2种抗体倍比稀释后对于VgrG1a抗原的亲和力,结果显示人鼠嵌合型8A4F5抗体与抗原VgrG1a亲和力较高,半人源化成功(图 7 B)。
3 讨论铜绿假单胞菌存在多个分泌系统[18],其中研究比较多的是T3SS,目前已有制药公司研发了针对T3SS针头PcrV结构蛋白的单抗,并且在临床试验中取得了较好的效果[19-20]。T6SS是最近几年研究较多的分泌系统,广泛存在于许多革兰阴性菌中,在细菌间竞争、抗真菌等微生物生态系统或金属离子等摄取中发挥着重要作用[21-22]。T6SS由13个保守结构组成,多由H1-T6SS基因簇编码。VgrG1a蛋白为铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统的结构蛋白,位于注射器的针头部位,通过刺入靶细胞的细胞膜,到达细胞周质,发挥递送效应蛋白的作用[23]。VgrG1a不含扩展的功能结构域PAAR,与VgrG1b和VgrG1c三者同属于经典VgrGs[24]。在铜绿假单胞菌培养上清中常能检测到此蛋白,所以VgrGs也被当做铜绿假单胞菌的特征性蛋白。VgrG1a多以三聚体的形式存在,也可检测到部分单体形式,故推测此蛋白稳定性可能较差[25]。
VgrG1蛋白是Ⅵ型分泌系统的核心组件,类似于噬菌体的尾巴,与收缩装置Hcp相连,在受到外界刺激的情况下将毒素刺入原核或真核细胞内。不同菌种的VgrG1的大小和功能各不相同。铜绿假单胞菌的VgrG1约含643个氨基酸,大肠杆菌VgrG1约有841个氨基酸,而鲍曼不动杆菌的VgrG1含有1 000多个氨基酸。霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的VgrG1是一种具有肌动蛋白交联域(ACD)的功能蛋白,通过交联G-肌动蛋白导致细胞骨架重排,防止被巨噬细胞吞噬[26]。在条件性致病AbCAN2型菌鲍曼不动杆菌中,既存在具有核酸酶功能的VgrG1,还存在VgrG的同源物抑制鲍曼不动杆菌T6SS的活性[27]。造成鱼类败血症的嗜水气单胞菌,感染猪的肠外致病大肠杆菌和植物病害相关的根癌农杆菌中也存在依赖于T6SS的VgrG1蛋白,可见Ⅵ型分泌系统影响着人们生活的方方面面。
目前,关于铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白在铜绿假单胞菌导致的人体感染中的具体作用尚不明确。最新的研究[17, 28]指出,铜绿假单胞菌在菌间竞争中会表达Ⅵ型分泌系统,VgrG1a蛋白属于依赖于Ⅵ型分泌系统分泌的众多针头蛋白的一员,VgrG1a蛋白携带的毒素Tse6被发现具有NAD(P)酶的作用,可通过延缓竞争菌内能量的代谢达到抑菌作用。
本研究通过大肠杆菌原核系统表达带有6×His标签的VgrG1a,在通过Western印迹和ELISA实验分别鉴定后,得出此蛋白为实验所需目的蛋白。再用VgrG1a当作抗原,免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤的融合和有限稀释法筛选后,制备出特异度较高的鼠源性单抗,并完成了单抗的半人源化。此人鼠嵌合型单抗对VgrG1a蛋白显示出良好的特异性和较高的亲和力,为进一步研究VgrG1a蛋白的结构和功能及其在抗铜绿假单胞菌感染中发挥的作用奠定了基础。
利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突。
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