2021, Vol. 28
肺癌已成为全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。近年来，肺癌的病理类型谱发生了显著变化：肺腺癌的发生率不断上升，已超越鳞癌，成为最常见的肺癌组织学类型[1]。在肺腺癌中，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的激活突变是最常见的驱动基因突变，以吉非替尼和厄洛替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)可显著延长含EGFR敏感突变(19del、21-L858R)肺腺癌患者的无进展生存期(progression-free-survival，PFS) [2]。但是，即使对EGFR-TKIs初治高度敏感的患者，在经过9~11个月的中位PFS后，几乎都不可避免地产生耐药，这极大限制了其临床治疗效果[3]。目前关于EGFR-TKIs的耐药机制主要包括：靶基因的二次突变，如T790M突变[4]；EGFR旁路的持续激活，如MET扩增[5]；表型和组织学类型的转化，如小细胞转化和上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)[6]，但仍有部分耐药机制尚未阐明。因此，深入研究EGFR-TKIs耐药的相关机制，制订相应的策略，具有重要的理论价值和临床意义。
CXC趋化因子受体4(CXCR4)在多种肿瘤细胞中明显高表达，与肿瘤的发生和发展密切相关[7-8]。且CXCR4的高表达可显著降低肿瘤的化疗药物敏感性、诱导化疗耐药[9-10]。值得注意的是，肺腺癌细胞在出现吉非替尼耐药后，CXCR4的表达水平较耐药前显著升高[11]。但CXCR4高表达与肺腺癌细胞吉非替尼耐药的相关性目前仍不明确。因此，本研究旨在通过体外及体外试验初步探讨CXCR4高表达诱导肺腺癌细胞产生吉非替尼耐药的相关机制。
1 材料与方法 1.1 细胞培养PC9(含EGFR-19del突变的吉非替尼敏感的肺腺癌细胞)、PC9/GR(含EGFR-19del突变的吉非替尼耐药的肺腺癌细胞)均购于湖南丰晖生物科技有限公司；PC9细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，PC9/GR细胞按细胞说明书要求培养于加有2 μmol/L吉非替尼(Selleck公司)的含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。
1.2 RNA干扰PC9/GR细胞对数生长期时，消化后铺板，待细胞融合度达到30%~50%时，采用脂质体转染方法对细胞进行siRNA转染以下调胞内CXCR4水平，转染方法按照Lipo2000说明书。针对CXCR4的mRNA设计siRNA：siCXCR4-1的靶序列为5′-GGU ACU UUG GGA ACU UCC U-3′(F)、5′-AGG AAG UUC CCA AAG UAC C-3′(R)；si-CXCR4-2的靶序列为5′-CCU GUC CUG CUA UUG CAU U-3′(F)、5′-AAU GCA AUA GCA GGA CAG G-3′ (R)；siCXCR4-3的靶序列为5′-GUG AGU UUG AGA ACA CUG U-3′(F)、5′-ACA GUG UUC UCA AAC UCA C-3′(R)。siRNA-NC为非特异性非相关的RNA片段，作为对照组。
1.3 慢病毒感染采用CRISPR/CAS9(汉尹生物科技有限公司)技术设计、构建、包装过表达ovCXCR4及对照ovCtrl的慢病毒载体，测定慢病毒滴度；2×105/孔的PC9细胞接种于6孔板，培养24 h后，移入生物安全柜操作，按照产品说明书滴加慢病毒；按1∶1 000比例加入polebrene混匀；慢病毒感染24 h后换液；48 h后加入适量嘌呤霉素继续培养72 h，去除未成功感染慢病毒的细胞；待细胞扩增至长满80%的6孔板后，消化、收集细胞。qRT-PCR、Western印迹检测CXCR4表达情况，鉴定感染效果。
1.4 qRT-PCR和Western印迹检测细胞总RNA提取、qRT-PCR、细胞总蛋白提取、Western印迹检测等步骤参照既往文献[12]报道方法进行。细胞总RNA提取、qRT-PCR：吸去培养液，PBS清洗1次，加入Buffer RZ裂解液裂解细胞，按细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取细胞总RNA，经反转录获得cDNA，将cDNA用作RT-PCR模板，按TaKaRa荧光定量PCR试剂盒说明书配制试剂和样品，加入20 μL反应体系于ABI Prism 7500实时PCR仪器反应。CXCR4引物合成于上海生工生物科技有限公司，为5′-TGT CAT CTA CAC AGT CAA CCT C-3′(F)、5′-CAA CAT AGA CCA CCT TTT CAG C-3′(R)。β-actin引物序列为5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′(F)、5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′(R)。
细胞总蛋白提取、Western印迹检测：去细胞培养液，PBS洗涤2遍，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞10 min，4℃离心(13.8×g)10 min后取上清液，获得总蛋白。BCA法测定蛋白浓度；加入SDS加样缓冲液，100℃煮沸10 min使蛋白变性。按5~10 g样品上样，经电泳、转膜、封闭、一抗孵育过夜、洗膜、二抗孵育、洗膜后，采用ECL试剂显色发光。一抗货号：pEGFR(#3777), EGFR(#2085), pAKT(#2965), AKT(#9272), pERK1/2(#4370), ERK1/2(#4695), Cleaved caspase 3(#9664), BAK(#6947), BCL-2(#3498), BCL-XL(#2764), 乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA，#3582)，pLDHATyr10(#8176), β-actin(#4970)均购自美国赛信通公司；CXCR4抗体(ab181020)购自英国Abcam公司。
1.5 克隆形成、CCK-8、流式细胞凋亡术 1.5.1 克隆形成实验将细胞按1.5×103个/孔接种到6孔板中，细胞贴壁24 h, 根据实验目的(转染siRNA/加入抑制剂)经相应处理后持续培养2周，4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野中含50个以上细胞的集落，计数、求平均值并统计。
1.5.2 CCK-8检测将细胞按5×103个/孔接种到96孔板中，细胞贴壁24 h, 根据实验目的(转染siRNA/加入抑制剂)经相应处理72 h后，进行细胞活力检测，具体步骤按照CCK-8说明书进行；将CCK-8试剂与无血清培养液进行1∶9混合，弃去细胞培养液，分别于对应孔中加入100 μL CCK-8混合液，37℃孵育1~2 h，采用酶标仪检测450 nm的光密度(D)值，计算并统计细胞相对增殖活力。
1.5.3 流式细胞凋亡术将细胞按4×104个/孔接种到24孔板中，细胞贴壁24 h，根据实验目的(siRNA干扰/加入抑制剂)经相应处理48 h后，消化、收集细胞。4℃预冷的PBS洗涤细胞，2次4℃离心(300×g)5 min；250 μL 1×binding buffer重悬细胞；根据Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(翌圣生物科技有限公司)说明书，取100 μL细胞悬液，加入流式抗体5 μL APC-Annexin Ⅴ和10 μL PE-PI，室温避光反应15 min，每管加入4℃预冷的PBS 400 μL终止反应，上机并检测[13]。
1.6 裸鼠皮下成瘤动物研究和实验方案已获得复旦大学实验动物中心批准(B2021-128)，根据动物安置和护理准则对动物进行饲养和处理。本研究使用4~6周龄清洁级雌性裸鼠(上海杰思捷公司)，饲养于复旦大学上海医学院SPF级动物房(12 h/12 h光照/黑暗周期)。每只小鼠皮下注射2×106个细胞，荷瘤小鼠饲养2周后随机分组(3只小鼠/组)：Ctrl(PBS)、Gef (gefitinib; 30 mg/kg，灌胃，qd×3周)；AMD(AMD 3100; 5 mg/kg，腹腔注射，qd×4周)；AMD+Gef(AMD预处理1周，然后用Gef处理)；Oxa(oxamate; 750 mg/kg，腹腔注射，qd×4周)；Oxa+Gef(Oxa预处理1周，然后用Gef处理)。每3 d用游标卡尺测量皮下瘤直径，评估并统计。
1.7 免疫共沉淀扩增并收集过表达CXCR4的PC9细胞，细胞经IP裂解液裂解，取上清后加入抗CXCR4抗体/IgG，4 ℃振荡过夜，免疫复合物溶液与Protein A/G磁珠在室温下混合孵育，洗涤，留取阴性参照、阳性参照、IP液，经上样、电泳、考马斯亮蓝染色后送上海维基生物科技有限公司行蛋白胶条Shotgun质谱分析，Western印迹验证质谱。具体步骤参照既往文献[14]。
1.8 葡萄糖消耗量和乳酸生成量测定将细胞按3×105个/孔接种到6孔板中，贴壁24 h；将培养液更换为无酚红(赛默飞世尔科技有限公司，美国)低葡萄糖DMEM液。根据实验目的(siRNA干扰/加入抑制剂)经相应处理48 h后，从每个孔中收集50 μL培养液等分试样，以950 μL蒸馏水(1∶20)稀释。使用葡萄糖检测试剂盒(Sigma-Aldrich)，按照产品说明书设定空白孔、标准孔、测定孔，加入显色剂后37℃环境反应15 min，酶标仪测定505 nm处的各测试孔D值，计算并统计细胞的葡萄糖消耗量；使用乳酸检测试剂盒(南京建成生物工程公司)，按照产品说明书设定空白孔、标准孔、测定孔，加入显色剂后37℃环境反应10 min，酶标仪测定530 nm处的各测试孔D值，计算并统计细胞的乳酸生成量。具体步骤参照既往文献[15]。
1.9 统计学处理采用GraphPad Prism软件分析数据，采用t检验比较差异。细胞实验每项重复3次。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 PC9/GR细胞的吉非替尼耐药性鉴定克隆形成(图 1A)、CCK-8检测(图 1B)结果显示，在吉非替尼作用下，PC9/GR显示出显著增强的增殖能力；PC9/GR、PC9细胞的吉非替尼半抑制浓度IC50分别是19.15 μmol/L、0.195 μmol/L，前者明显高于后者；在吉非替尼作用下，PC9细胞中pAKT、pERK明显下调，而在PC9/GR细胞中无明显下调，提示PC9/GR可显著抵抗吉非替尼对EGFR下游通路的抑制作用(图 1C)；PC9/GR较PC9细胞存在显著增强的抗凋亡能力(图 1D)；PC9细胞的促凋亡蛋白如cleaved-caspase3、BAK明显上调而抗凋亡蛋白如BCL-XL、BCL-2明显下调，PC9/GR中凋亡蛋白均变化不明显(图 1E)。体内实验提示，吉非替尼可显著抑制PC9细胞的皮下成瘤，而对PC9/GR的抑制并不明显(图 1F)。以上结果表明PC9/GR细胞存在良好的吉非替尼耐药性。qRT-PCR和Western印迹检测结果(图 1G)显示，CXCR4在PC9/GR细胞中的表达明显高于PC9细胞。
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| 图 1 PC9/GR细胞的吉非替尼耐药性鉴定 A：克隆形成；B：CCK-8检测；C：EGFR信号通路；D：FACS细胞凋亡；E：凋亡蛋白；F：裸鼠皮下成瘤；G：CXCR4表达水平检测。Gef：gefitinib; **P < 0.01，***P < 0.001。 |
结果(图 2)显示：抑制PC9/GR细胞的CXCR4后，吉非替尼可显著抑制细胞克隆形成(图 2A)；降低吉非替尼IC50(图 2B)；促进细胞凋亡(图 2C)，上调促凋亡蛋白、下调抑凋亡蛋白(图 2D)，抑制细胞的EGFR下游信号通路(图 2E)；在体内，吉非替尼可显著抑制细胞的皮下成瘤(图 2F)。以上结果表明，CXCR4受抑后可显著逆转PC9/GR细胞的吉非替尼耐药性。
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| 图 2 抑制CXCR4可逆转PC9/GR细胞的吉非替尼耐药性 A：克隆形成；B：CCK-8检测；C：EGFR信号通路；D：FACS细胞凋亡；E：凋亡蛋白；F：皮下成瘤. Gef: gefinitib; AMD: AMD3100; **P < 0.01，***/****P < 0.001。 |
过表达CXCR4后，PC9细胞的克隆形成能力明显增强(图 3A)；吉非替尼IC50显著增加(图 3B)；抗凋亡能力明显增强(图 3C、图 3D)；显著抵抗吉非替尼对细胞EGFR下游通路的抑制作用(图 3E)；在体内，CXCR4过表达细胞可显著抵抗吉非替尼对皮下成瘤的抑制(图 3F)。以上结果表明，过表达CXCR4可诱导PC9细胞产生吉非替尼耐药。
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| 图 3 过表达CXCR4可诱导PC9细胞产生吉非替尼耐药 A：克隆形成；B：CCK-8检测；C：EGFR信号通路；D：FACS细胞凋亡；E：凋亡蛋白；F：皮下成瘤. Gef: Gefinitib; *P < 0.05, **P < 0.01, ***/****P < 0.001。 |
结果(图 4)显示：多种蛋白可直接结合于CXCR4分子，其中LDHA与CXCR4的结合丰度最高(图 4A)；CXCR4抗体可检测到结合的LDHA(图 4B)，而LDHA抗体可检测到结合的CXCR4(图 4C)。因此，LDHA和CXCR4存在相互作用。在PC9细胞中过表达CXCR4时，LDHA蛋白水平没有改变，而LDHA的Y10磷酸化水平显著增加(图 4D)；细胞的葡萄糖消耗量(图 4E)和乳酸生成量明显上调(图 4F)。因此，CXCR4过表达可促进LDHA磷酸化，从而增强细胞的有氧糖酵解。
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| 图 4 CXCR4过表达促进LDHA磷酸化并增强PC9细胞的有氧糖酵解 A: 免疫沉淀结合质谱分析筛选CXCR4相互作用蛋白；B、C：Western blot验证质谱；D：LDHA状态检测；E: 葡萄糖消耗量；F：乳酸生成量检测。**P < 0.01。 |
结果显示：PC9/GR细胞中的pLDHA水平显著高于PC9细胞(图 5A)，葡萄糖消耗量(图 5B)和乳酸生成量(图 5C)明显升高。抑制CXCR4不改变LDHA表达，但显著下调了PC9/GR细胞中的pLDHA水平(图 5D)，并明显降低PC9/GR细胞的葡萄糖消耗量(图 5E)和乳酸生成量(图 5F)。因此，抑制CXCR4可下调PC9/GR细胞的LDHA磷酸化并降低其有氧糖酵解功能。
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| 图 5 抑制CXCR4可下调PC9/GR细胞中LDHA磷酸化并降低有氧糖酵解 A~C：PC9/GR细胞中LDHA磷酸化和有氧糖酵解增加；D~F：抑制CXCR4，PC9/GR细胞的LDHA磷酸化和糖酵解被下调. AMD: AMD3100; *P < 0.05, **P < 0.01。 |
以糖酵解抑制剂(Oxamate和2-DG)预处理过表达CXCR4的PC9细胞，结果发现：吉非替尼可显著抑制细胞增殖(图 6A)；明显降低细胞的吉非替尼IC50(图 6B)；促进细胞凋亡(图 6C)，上调促凋亡蛋白、下调抑凋亡蛋白(图 6E)；在体内，吉非替尼可显著抑制细胞的皮下成瘤(图 6D)。因此，抑制有氧糖酵解可逆转CXCR4诱导的吉非替尼耐药。
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| 图 6 抑制有氧糖酵解可逆转CXCR4诱导的吉非替尼耐药 A: 克隆形成；B：CCK-8检测；C：EGFR信号通路；D：FACS细胞凋亡；E：凋亡蛋白；F：皮下成瘤。Gef: gefinitib; AMD: AMD3100; Oxa: Oxamate; **P < 0.01, ***/****P < 0.001。 |
在过去的十几年中，EGFR-TKIs使含EGFR敏感突变的非小细胞肺癌明显受益。但是，EGFR-TKIs的临床获益是有限的：几乎所有患者都不可避免地出现了疾病的进展，此即EGFR-TKIs耐药，也给肺癌的临床治疗带来了新的困难[16-18]。因此，深入研究EGFR-TKIs的耐药机制，有针对性地制订相应策略，对控制病程、改善预后具有重要的理论意义和临床应用价值。
CXCR4作为一种7次跨膜的G蛋白偶联受体，可异常表达于多种肿瘤细胞中，在与其配体SDF-1α结合后，酪氨酸激酶活性被激活，从而引发下游信号蛋白的酪氨酸磷酸化，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移。Phillips等[19]报道，多种非小细胞肺癌细胞系中存在CXCR4高表达；干扰细胞的CXCR4表达或使用特异性抑制剂阻断CXCR4通路后可明显降低细胞的侵袭和迁移能力。此外，CXCR4高表达可明显促进肺癌细胞的淋巴结转移，且与患者的总体预后负相关[20]。随着研究的深入，CXCR4过表达可诱导肿瘤细胞产生化疗耐药，阻断CXCR4通路后可恢复癌细胞的化疗敏感性[9-10]。引起我们关注的是，据Jung等[11]报道，野生型EGFR(A549/GR)的肺腺癌细胞在出现吉非替尼耐药后，CXCR4的表达水平较母细胞(A549)显著升高。但CXCR4是否参与了吉非替尼耐药，尚无相关报道。本研究证实，PC9/GR细胞的吉非替尼耐药性良好，且存在CXCR4明显高表达，CXCR4受抑后可逆转PC9/GR的吉非替尼耐药；而在PC9细胞中过表达CXCR4后可诱导细胞产生吉非替尼耐药。本研究首次揭示了在含EGFR敏感突变的肺腺癌细胞中，CXCR4的表达和活性对吉非替尼的药物敏感性具有重要的调控作用。
与正常细胞在有氧条件下使用线粒体氧化磷酸化供能方式不同，肿瘤细胞即使在氧供充足的情况下亦优先通过葡萄糖的糖酵解供能，即有氧糖酵解，以维持肿瘤细胞的无限增殖和持续生长，这种能量重编被称为Warburg效应[21]。作为有氧糖酵解的关键酶之一，LDHA可催化丙酮酸和NADH转化为乳酸和NAD+，其异常表达与多种恶性肿瘤密切相关。本研究证实，CXCR4不影响LDHA蛋白的表达水平；但是过表达CXCR4可显著促进细胞的LDHA磷酸化，上调有氧糖酵解水平；抑制CXCR4后细胞中LDHA磷酸化和糖酵解水平均显著下调；抑制有氧糖酵解可逆转CXCR4过表达所诱导的肺腺癌细胞吉非替尼耐药。
本研究尚有不足之处：CXCR4是否同样在含EGFR突变的其他细胞系，如HCC827、H1975等细胞中，发挥吉非替尼耐药的调控作用需要进一步验证；另外，还需收集临床肺腺癌肿瘤样本，检测吉非替尼耐药前后的CXCR4和LDHA、pLDHA水平，进一步验证CXCR4和LDHA的相关性。
综上所述，本研究结果表明CXCR4过表达可诱导肺腺癌细胞产生吉非替尼耐药；从机制上揭示了CXCR4过表达通过对LDHA磷酸化的促进而增强细胞有氧糖酵解功能；有氧糖酵解受抑后可显著逆转CXCR4诱导的吉非替尼耐药。本研究为解释吉非替尼耐药的发生机制补充了理论基础，对克服吉非替尼耐药提供了新的靶点和实验依据。
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