2021, Vol. 28
过敏性紫癜(Henoch-Schönlein purpura, HSP)是一种常发生于儿童的小血管炎，可导致各种临床症状，如皮肤紫癜、关节炎和(或)关节痛、腹痛和肾脏受累表现。其中，20%~55%的过敏性紫癜患儿会发生肾脏损害[1]，部分肾损害可进展为肾功能不全，导致患儿不良远期预后。目前，HSP的发病率呈逐年升高趋势，但其病因和发病机制仍不清楚。
细胞因子参与维持人体免疫系统促炎和抗炎功能的动态平衡[2]。首先促炎因子促进自身免疫性炎症的启动和扩散，随后抗炎因子促进炎症消退和急性期恢复，并诱导自身抗体聚集[3]。白细胞介素-1(IL-1)是一种典型的促炎细胞因子，其中IL-Iβ是内皮细胞以自分泌方式表达IL-1的重要刺激因子。T细胞中的IL-1β可诱导显著而持久的一级和二级CD4反应[4]。
HSP具有家族聚集性，即遗传因素可能在其发病过程中起重要作用[5]。B淋巴细胞多克隆活化为HSP特征，而IL-1β参与刺激B细胞增殖和分化，由此推测IL-1β功能异常可能参与HSP的发生。rs1143627可能影响IL-1β转录因子转录调节区功能，通过降低细胞因子IL-1Ra的拮抗特性而影响IL-1β水平[6]。因此，本研究对IL-1β基因rs1143627位点的单核苷酸多态性与HSP及紫癜性肾炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis, HSPN)的相关性进行探讨，以期为HSPN的个性化治疗提供理论依据。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2017年1月至2019年12月青岛大学附属医院儿科收治的174例HSP患儿作为病例组。所有患儿均符合2006年EULAR/PReS制定的儿童血管炎分类标准，至少随访6个月。所有参与者均通过临床和实验室检查筛查，排除免疫性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、败血症、其他肾脏疾病和外科急腹症等疾病。本研究方案由青岛大学附属医院伦理委员会批准，并取得家属知情同意。
1.2 诊断标准HSP诊断参考EULAR/PReS 2006年制定的儿童血管炎分类标准[7]，即可触性(必要条件)皮疹伴以下任意1条：(1)弥漫性腹痛；(2)任何部位活检示IgA沉积；(3)关节炎或关节痛；(4)肾脏受损表现[血尿和(或)蛋白尿]。HSPN的诊断及肾脏病理分级参考中华医学会儿科学分会肾脏病学组2009年制定的诊治循证指南[8]：在HSP 6个月病程内，出现血尿和(或)蛋白尿。
1.3 分组根据临床症状将病例组分为单纯型组(仅表现为皮肤紫癜)、关节型组(皮肤紫癜合并关节症状)、腹型组(皮肤紫癜合并消化道症状)、混合型组(皮肤紫癜合并关节症状，同时伴有消化道症状)；根据随访过程中是否发生HSPN分为非HSPN组、HSPN组。另选择162名于我院体检的年龄匹配的健康儿童作为对照组。
1.4 IL-1β基因rs1143627位点检测及测序 1.4.1 标本收集及DNA提取清晨抽取患者空腹外周静脉血2 mL，置于EDTA抗凝管中，于-80℃冰箱保存备用。使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.4.2 引物设计与合成应用Primer 3软件针对目的基因全长进行特异性多重引物设计(表 1)。引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
| 正/反链 | 引物序列(5'-3') | 片段大小 |
| F | TCA TAC TTG AGC AAT GAA GAT TGG | 393 bp |
| R | GAA GCT TCC ACC AAT ACT CTT TTC | 607 bp |
| R反义链 | GAA AAG AGT ATT GGT GGA AGC TTC | 417 bp |
PCR反应扩增条件：94 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸5 min，共30个循环。将PCR产物进行电泳检测，采用3%琼脂糖凝胶，PCR产物上样5 μL(图 1)，根据多重PCR重数确定稀释小试样本数，进行qPCR检测(图 2)。通过双端barcode原理区分不同样本并混样建库后，在Illumina X-10平台测序。
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| 图 1 部分DNA样品PCR电泳结果 |
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| 图 2 qPCR结果 |
采用SPSS 22.0进行统计，用Sequencer 4.9软件对测序结果进行分析。定量资料采用x±s表示，连续变量资料采用t检验。两组间定性资料的比较采用χ2检验。采用95%置信区间(95%CI)和优势比(OR)评价rs1143627与各组间的相关性。
2 结果 2.1 HSP患儿临床病理特点174例HSP患儿中，单纯型40例、关节型77例、腹型24例、混合型33例，均在门诊接受了至少6个月的随访，平均随访(9.1±2.7)个月。随访结果显示104例HSP患儿完全缓解(尿检无异常，非HSPN组)，70例患儿表现为持续肾脏损伤(HSPN组)。HSPN组70例患儿中孤立性血尿28例(40.0%)、孤立性蛋白尿22例(31.4%)、血尿合并蛋白尿20例(28.6%)。HSPN组70例患儿中12例行肾脏穿刺活检，病理分级：Ⅰ级2例，Ⅱa级2例，Ⅲa级3例，Ⅲb级3例，Ⅳa级1例，Ⅳb级1例。病例组与对照组、非HSPN组与HSPN组间研究对象年龄、性别差异均无统计学意义(表 2)。
| 组别 | n | 平均年龄/岁 | 性别(男/女) |
| 对照组 | 162 | 6.9±2.5 | 90/72 |
| 病例组 | 174 | 6.7±2.2 | 89/85 |
| 非HSPN组 | 104 | 6.7±3.2 | 58/46 |
| HSPN组 | 70 | 7.1±2.3 | 31/39 |
rs1143627基因型频率与等位基因在病例组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05，表 3)。等位基因G(OR=0.671，95%CI 0.494~0.911)可能是HSP发病的危险因素
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| rs1143627 | 病例组 (n=174) |
对照组 (n=162) |
χ2值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
| 基因型 | 8.2293 | 0.016 | |||||||||||||||||||||||||||
| AA | 38(21.9) | 58(35.8) | |||||||||||||||||||||||||||
| AG | 97(55.8) | 77(47.5) | |||||||||||||||||||||||||||
| GG | 39(22.4) | 27(16.7) | |||||||||||||||||||||||||||
| 等位基因 | 6.5709 | 0.010 | |||||||||||||||||||||||||||
| A | 173(49.7) | 193(59.6) | |||||||||||||||||||||||||||
| G | 175(50.3) | 131(40.4) | |||||||||||||||||||||||||||
rs1143627基因型频率与等位基因在HSP不同临床症状分组间差异无统计学意义(表 4)。
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| rs1143627 | 单纯型组(n=40) | 关节型组(n=77) | 腹型组(n=24) | 混合型组(n=33) | χ2值 | P值 | |||||||||||||||||||||||
| 基因型 | 4.9893 | 0.545 | |||||||||||||||||||||||||||
| AA | 5(12.5) | 21(27.3) | 5(20.8) | 7(21.2) | |||||||||||||||||||||||||
| AG | 26(65.0) | 42(54.5) | 12(50.0) | 17(51.5) | |||||||||||||||||||||||||
| GG | 9(22.5) | 14(18.2) | 7(29.2) | 9(27.3) | |||||||||||||||||||||||||
| 等位基因 | 2.6371 | 0.451 | |||||||||||||||||||||||||||
| A | 36(45.0) | 84(54.5) | 22(45.8) | 31(47.0) | |||||||||||||||||||||||||
| G | 44(55.0) | 70(45.5) | 26(54.2) | 35(53.0) | |||||||||||||||||||||||||
rs1143627基因型与等位基因在非HSPN组与HSPN组中差异均有统计学意义(P＜0.05，表 5)。等位基因G(OR=1.731, 95%CI 1.123~2.669)可能是HSPN发病的危险因素。
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| rs1143627 | 非HSPN组 (n=104) |
HSPN组 (n=70) |
χ2值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
| 基因型 | 7.4521 | 0.024 | |||||||||||||||||||||||||||
| AA | 16(15.4) | 22(31.4) | |||||||||||||||||||||||||||
| AG | 60(57.7) | 37(52.9) | |||||||||||||||||||||||||||
| GG | 28(26.9) | 11(15.7) | |||||||||||||||||||||||||||
| 等位基因 | 6.2151 | 0.013 | |||||||||||||||||||||||||||
| A | 92(44.2) | 81(57.9) | |||||||||||||||||||||||||||
| G | 116(55.8) | 59(42.1) | |||||||||||||||||||||||||||
Hardy-Weinberg平衡检验结果显示：rs1143627基因座的基因型与HSPN表型具有相关性(χ2=0.028，P=0.866)，表明该位点具有HSPN群体代表性。
3 讨论HSP是儿童最常见的系统性血管炎，在4~6岁儿童中发生率最高[9]。HSP患儿多可自行缓解，预后佳。然而，部分患儿可累及肾脏，并发展为慢性肾脏病。目前HSP的病因与发生机制尚不明确。在HSP急性期，血清IgA浓度升高，IL-2、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α (TNF-α)异常表达[5, 10]，提示该病为免疫介导性疾病。基因异常会影响细胞因子的表达，单核苷酸多态性改变可能影响对应细胞因子的功能。
IL-1β是IL-1的主要分泌形式，具有强促炎性和多效性，主要由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和B细胞产生。成熟的IL-1β通过刺激炎症和免疫相关基因的表达来介导炎症反应[11]；还参与刺激B细胞增殖和分化、共刺激T细胞和激活NK细胞。而B淋巴细胞多克隆活化为HSP特征。患儿T淋巴细胞和单核细胞CD40配体(CD40L)也过度表达，促进B淋巴细胞分泌大量IgA和IgE。
系统性血管炎性疾病(如HSP)患者各器官组织的慢性炎症反应常由TNF-α、IL-6和IL-1β等多种细胞因子异常高表达引发。类风湿性关节炎(RA)、2型糖尿病、川崎病等炎症性疾病[12-15]的易感性与IL-1β基因多态性的关系得到了证明。此外，一项研究在IL-1β缺陷小鼠模型(IL-1β-/-和IL-1α/β-/-)中发现，IL-1β介导的免疫刺激和炎症反应在系统性红斑狼疮发病中发挥作用[16]。本研究结果显示，与对照组相比，病例组IL-1β rs1143627位点GG基因型频率增加(P=0.016)，且等位基因G频率增加(P=0.010)，故推测等位基因G可能是HSP易感的危险因素。
成熟的IL-1β基因能刺激环氧合酶2和诱导型一氧化氮合酶基因(NOS2A)等(炎症和免疫相关基因的表达)[11]。NOS2A能诱导内皮细胞活化，进而释放一氧化氮(NO)和大量细胞因子，影响白细胞游走、迁移以及黏附，并能影响黏附因子的活性，最终损伤血管壁、肾脏等组织。Martin等[17]发现，HSP患者和对照组NOS2A启动子等位基因和基因型频率差异明显，表明该基因在HSP易感性和肾炎发展中具有潜在作用。本研究显示，非HSPN组rs1143627位点GG基因型频率高于HSPN组(P=0.024)，且两组等位基因G差异有统计学意义(P=0.013)，进一步说明rs1143627位点基因型GG与等位基因G可能是HSP的易感基因，且与HSPN的发生有关。
另外，一项检测炎症对脂质代谢影响的研究[18]发现，IL-1β可导致肾小球系膜细胞中胆固醇酯积累，从而导致活性氧产生和内质网应激。活性氧代谢产物可引起多种病理破坏，包括系统性血管炎和肾脏疾病。HSP患者氧化应激水平升高，脂质过氧化可能在HSP发病和肾损伤的发生发展中发挥重要作用[19]。
本研究中，rs1143627位点基因型和等位基因在病例组临床症状分型中差异无统计学意义。该结果可能与各分型样本量较少有关，后期会通过加大样本量继续证实。同时，尚需在多中心、多地区、多民族人群中验证本研究结果。
综上所述，IL-1β作为参与免疫反应的重要因子，其基因多态性与HSP及肾损害密切相关，其rs1143627位点等位基因G可能是儿童HSP及肾脏损伤的危险因素。该位点基因多态性可能通过影响基因调控导致患者血清细胞因子水平改变而致病。建立基因型与其表型之间的功能相关性模型是决定基因多态性临床意义的关键，并能为患儿的个体化治疗提供依据。
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