2020, Vol. 27
胃溃疡是常见的消化系统疾病，临床患者常表现为反酸、腹胀、嗳气、餐后上腹部疼痛等，其患病率高，有反复发作的倾向，严重者可能并发上消化道出血、穿孔、梗阻和癌变[1]。半夏泻心汤作为《伤寒杂病论》中的传统方剂，主治寒热错杂之心下痞证，具有调理脾胃气机升降的功效。大量临床及文献报道[2]证实，其针对消化性溃疡有良好的治疗效果。本研究在构建大鼠乙酸型胃溃疡模型的基础上，探讨半夏泻心汤对大鼠乙酸型胃溃疡模型的溃疡指数、溃疡抑制率、胃酸pH、血清一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(i-NOS)、总一氧化氮合酶(t-NOS)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达等指标的影响，进一步探索各项指标间的联系，为其临床应用提供实验依据。
1 资料与方法 1.1 实验动物选用SPF级Wistar健康大鼠，48只，雄性，体质量(200±20)g。动物由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号为SCXR(辽)2010-0001。实验前大鼠在实验室内正常饲养1周，温度22~25℃，湿度40%~60%，正常饮食饮水。
1.2 试剂与仪器半夏泻心汤组成：制半夏、黄芩、人参、干姜、灸甘草、黄连、大枣)。奥美拉唑肠溶胶囊：常州四药制药有限公司，批号H10950086。大鼠血清i-NOS，t-NOS分型测试盒：南京建成生物工程研究所生产，批号20130514；大鼠血清NO测试盒：南京建成生物工程研究所生产，批号20130514；大鼠胃组织VEGF抗体：武汉博士德生物工程有限公司，批号20130522。3-30k微量低温高速离心机(Sigma公司，德国)；PHS-3t型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司，中国)；722S分光光度计(上海棱光技术有限公司，中国)；XS125A电子天平(普利赛斯公司，瑞士)。
1.3 模型制备采用Okabe改良法[3]。大鼠术前禁食不禁水24 h。先用乙醚吸入法麻醉大鼠，翻正反射消失，双腿夹捏反射消失，说明大鼠已麻醉良好。将其固定于鼠板上，并于鼻旁追加麻醉，备皮，消毒，于剑突下1.5 cm处做腹正中切口2~3 cm，暴露全胃，以内径4 mm的玻璃管压在胃小弯近幽门处，向管内缓缓注入冰乙酸75 μL，30 s后用棉花吸尽冰乙酸，将胃还纳回腹腔，逐层缝合，放回鼠笼，禁食不禁水1 d后正常饮食饮水饲养。
1.4 分组及给药方法实验随机分为6组：正常组，模型对照组，半夏泻心汤低、中、高剂量组，奥美拉唑组，每组8只。半夏泻心汤参照《伤寒论》配伍，根据人鼠用量换算公式，换算大鼠的剂量，先用水浸泡30 min，文火煎30 min，双层纱布滤除药渣，将药液倒入瓶中，置冰箱备用。每天给药2次[4]，每次给药时，模型对照组取生理盐水4 mL，半夏泻心汤低剂量组取药液1 mL/kg，半夏泻心汤中剂量组取药液2 mL/kg，半夏泻心汤高剂量组取药液4 mL/kg，用蒸馏水定容至4 mL，半夏泻心汤组均在进食后给药。奥美拉唑组给予奥美拉唑肠溶胶囊0.36 g/kg，用蒸馏水定容至4 mL，1次/d，进食前服用。连续14 d。
1.5 检测指标给药后14 d检测以下各指标。
1.5.1 胃酸pH末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉，开腹，暴露全胃，结扎幽门后缝合，禁食禁水，4 h后结扎贲门，剪断贲门上端和幽门下端，分离出胃，收集胃液，1 500 r/min离心10 min，取上清，用pH计检测pH值。
1.5.2 血清i-NOS、t-NOS、NO采用眼球取血法，收集每只大鼠血3 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清，按试剂盒说明书操作。
1.5.3 溃疡指数[5]取完胃液后，将大鼠胃沿胃大弯剪开，放入生理盐水中浸泡，清洗干净，用滤纸吸干，置于培养皿上，用尺测量胃溃疡处的最长径和最宽径，测定溃疡指数(UI)=最长径×最短径×1/4×π。
1.5.4 溃疡组织VEGF蛋白表达Western印迹检测VEGF蛋白的表达：取制备好的蛋白样品，10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，100 mV转膜1 h，封闭1 h；一抗分别为抗VEGF(1:400)、抗肌动蛋白(抗β-actin，1:500)，4℃过夜。洗膜后，碱性磷酸酶标记的抗IgG抗体孵育1 h，显色液显色，凝胶成像系统下拍照，计算条带吸光度(A)值，VEGF蛋白表达水平分别以其与β-actin的A值的比值来表示。
1.6 统计学处理采用SPSS 13.0进行数据分析。计量资料以x±s表示，组间差异性比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 对溃疡指数的影响结果(表 1)表明：实验过程中，模型组死亡2只，低剂量组死亡1只，其余各组无死亡。与模型对照组相比，半夏泻心汤低剂量组溃疡指数减小(P＜0.05)，半夏泻心汤中、高剂量组和奥美拉唑组溃疡指数明显减小(P＜0.01)。与奥美拉唑组相比，半夏泻心汤高剂量组溃疡指数减小(P＜0.05)。与模型对照组相比，半夏泻心汤低剂量组溃疡抑制率增高(P＜0.05)，半夏泻心汤中、高剂量组和奥美拉唑组溃疡抑制率明显增高(P＜0.01)。与奥美拉唑组相比，半夏泻心汤高剂量组溃疡指数增高(P＜0.05)。
| x±s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 胃液pH值 | 溃疡指数 | 溃疡抑制率(%) | ||||||||||||||||||||||||||
| 正常组(n=8) | 2.67±0.13 | — | — | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型对照组(n=6) | 2.32±0.89 | 38.24±3.71 | 3.1 | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤高剂量组(n=8) | 4.03±0.31*△ | 14.99±3.26**△ | 62.7**△ | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤中剂量组(n=8) | 3.63±0.42* | 23.75±3.22** | 18.5** | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤低剂量组(n=7) | 3.21±0.22 | 30.58±3.83* | 6.3* | ||||||||||||||||||||||||||
| 奥美拉唑组(n=8) | 3.81±0.54* | 16.01±3.12** | 45.1** | ||||||||||||||||||||||||||
| *P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比；△P＜0.05与奥美拉唑组相比 | |||||||||||||||||||||||||||||
结果(表 1)表明：与模型组相比，半夏泻心汤低剂量组胃酸pH值无明显变化，半夏泻心汤中、高剂量组及奥美拉唑组胃酸pH值增高(P＜0.05)。与奥美拉唑组相比，半夏泻心汤高剂量组胃酸pH值升高(P＜0.05)。
2.3 对血清i-NOS、t-NOS、NO含量的影响结果(表 2)显示:与模型对照组相比，半夏泻心汤低剂量组血清i-NOS降低(P＜0.05)，t-NOS升高(P＜0.05)，NO升高(P＜0.05)，半夏泻心汤中、高剂量组及奥美拉唑组i-NOS显著降低(P＜0.01)，t-NOS增高(P＜0.05)，NO增高(P＜0.05)。与奥美拉唑组相比，半夏泻心汤高剂量组i-NOS显著降低(P＜0.01)，t-NOS增高(P＜0.05)，NO显著增高(P＜0.01)。
| x±s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | NO(nmol/L) | i-NOS(nmol/L) | t-NOS(nmol/L) | ||||||||||||||||||||||||||
| 正常组(n=8) | 42.13±9.65 | — | 3.32±0.52 | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型对照组(n=6) | 30.22±6.25 | 4.78±0.31 | 5.28±0.47 | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤高剂量组(n=8) | 39.24±5.12**△△ | 2.05±0.22**△△ | 7.12±0.44*△ | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤中剂量组(n=8) | 33.45±6.18* | 2.57±0.16** | 6.89±0.51* | ||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤低剂量组(n=7) | 30.73±7.11* | 4.09±0.58* | 5.76±0.47* | ||||||||||||||||||||||||||
| 奥美拉唑组(n=8) | 36.64±6.74* | 2.12±0.39** | 7.01±0.53* | ||||||||||||||||||||||||||
| *P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比；△P＜0.05，△△P＜0.01与奥美拉唑组相比 | |||||||||||||||||||||||||||||
在末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h后，处死大鼠，取其溃疡灶处，Western blot检测胃溃疡组织处的VEGF蛋白的表达。结果(图 1、表 3)表明：与模型对照组相比，半夏泻心汤低、中、高剂量组和奥美拉唑组VEGF表达增强(P＜0.05)。与奥美拉唑组相比，半夏泻心汤高剂量组VEGF表达增强(P＜0.01)。
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| 图 1 半夏泻心汤对各组大鼠VEGF表达的影响 |
| x±s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | VEGF蛋白表达(VEGF/β-actin) | ||||||||||||||||||||||||||||
| 正常组(n=8) | 0.03±0.01 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 模型对照组(n=6) | 0.37±0.05 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤高剂量组(n=8) | 1.42±0.12*△△ | ||||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤中剂量组(n=8) | 0.63±0.09* | ||||||||||||||||||||||||||||
| 半夏泻心汤低剂量组(n=7) | 0.44±0.08* | ||||||||||||||||||||||||||||
| 奥美拉唑组(n=8) | 0.88±0.10* | ||||||||||||||||||||||||||||
| *P＜0.05与模型对照组相比；△△P＜0.01与奥美拉唑组相比 | |||||||||||||||||||||||||||||
消化性溃疡作为消化系统的常见病，以胃和十二指肠溃疡最为多见。有研究[6]表明，半夏泻心汤能有效治疗消化性溃疡，其可通过提高VEGF的表达，增加再生黏膜厚度，促进血管新生和组织修复，从而缩小溃疡面积。也有研究[7]表明，半夏泻心汤能改善胃黏膜炎细胞浸润程度，并通过提高感染幽门螺旋杆菌小鼠血清中VEGF含量，增强机体胃黏膜保护作用。
本研究通过冰乙酸模拟人类消化性溃疡形成。利用不同剂量半夏泻心汤对大鼠胃溃疡模型进行治疗，测定不同组大鼠胃酸pH、溃疡指数、溃疡抑制率发现，在溃疡形成之后，药物作用下溃疡能更快愈合，且其与中药治疗存在量效关系。中等剂量与大剂量组的治疗效果优于小剂量，也优于西药组。结果表明，半夏泻心汤能有效减少大鼠胃酸分泌，减少大鼠胃液量，降低大鼠胃液pH值，促进溃疡愈合。
NO是人体一种重要的生物介质，由精氨酸经NOS(一氧化氮合酶)合成，在胃溃疡的愈合中发挥重要作用。有研究[8-9]证明，来源于i-NOS的NO对胃溃疡有损伤作用，而来源于e-NOS的NO则对胃溃疡有保护作用。低浓度的NO对胃溃疡有治疗作用，其机制是通过扩张局部血管，使胃溃疡处血流供应增加，或作为一种信号分子，诱导促进血管发生的细胞因子如血管内皮生长因子表达[10]，NO还可稳定HO-1(热休克蛋白)的mRNA[11]，而HO-1能激活血管内皮细胞，使其合成VEGF，促进血管发生[12]，然而高浓度的NO则可能致溃疡。本研究中，半夏泻心汤低、中、高组均能升高NO水平，其中高剂量组与奥美拉唑组相比，NO含量显著增加。NOS也与胃溃疡的发生和治疗紧密联系。乙酸型胃溃疡中i-NOS升高，e-NOS下降。本研究证明，半夏泻心汤能有效降低i-NOS，升高t-NOS，从而促进溃疡愈合，这可能与NOS的一种分型e-NOS通路有关[13]。
VEGF是一种血管内皮生长因子，能促进血管内皮的增殖分化，使血管新生，从而加速溃疡的愈合[14-15]。其发生与NO水平、vWF(von Willebrand factor Ⅷ)聚集释放水平均有关。本研究显示半夏泻心汤低、中、高剂量组和奥美拉唑组均表达VEGF，其中半夏泻心汤高剂量组和奥美拉唑组比较，半夏泻心汤高剂量组增加局部溃疡组织VEGF明显高于奥美拉唑组，同时，NO水平在半夏泻心汤低、中、高组中均高表达，尤其在高剂量组中显著表达，提示VEGF的表达和NO水平有关。结果提示半夏泻心汤可通过调控体内NO、VEGF、t-NOS水平，降低i-NOS水平，扩张局部血管供应，促进VEGF表达等作用与VEGF促进血管新生协同作用，保护胃黏膜，促进胃溃疡快速愈合。NO及其合酶可能是半夏泻心汤发挥作用的靶点之一。
综上所述，半夏泻心汤对胃溃疡有良好的治疗作用，促进胃溃疡部愈合。通过减少胃酸分泌，降低胃液pH值，提高胃黏膜保护因子NO和VEGF的表达，提高t-NOS，降低i-NOS，增加胃黏膜的防御能力。
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