2020, Vol. 27
颗粒细胞(granulosa cells, GCs)是结构以及功能与卵细胞联系最为密切的细胞，与卵细胞共同构成卵泡，并以卵泡为结构与功能单位，与卵细胞一同发育。颗粒细胞的形态以及数目是卵泡分期的重要依据。
卵泡发育是一个复杂而漫长的过程，整个过程受到多种细胞因子与激素的精细调控。这些因素影响卵细胞及颗粒细胞分化、增殖以及凋亡。从原始卵泡召集到最终排卵的整个过程中，约有99%的卵泡被淘汰而发生闭锁[1]。卵泡的成熟或闭锁取决于这些信号分子间不同时期的动态平衡，而颗粒细胞是这些信号分子影响卵泡发育的重要“中介”。
1 卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡及其意义颗粒细胞以旁分泌的形式产生激素并作用于卵细胞，从而调控卵细胞的发育状态；同时也以自分泌的方式调控自身的分化、增殖及凋亡。另一方面，颗粒细胞受各种细胞因子、激素及生长因子的调控，并通过与卵细胞的间隙连接将相应信号传递到卵细胞中调控其发育状态。颗粒细胞在卵泡发育过程中，同时起产生信号、传递信号及接收信号的作用，即颗粒细胞的发育状态决定了卵泡的命运。
作为细胞自主发生的一种死亡模式，凋亡在组织发育、疾病发生发展中扮演着重要的角色。在卵泡发育过程中，颗粒细胞凋亡通常被认为是卵泡闭锁的“起因”[2]。有学者提出“卵泡波”(follicular wave)理论，认为卵泡并不是随机生长，而是协调地按批次进行发育[3]。在排卵间隔期，共发生2~3次发育波，期间卵泡必须通过闭锁有效地去除其他生长的卵泡，以适应随后的卵泡生长波，此时卵泡分化成为优势卵泡及从属卵泡，只有优势卵泡能进一步发育，为卵细胞的分裂及后续受精作准备。卵泡分化为从属卵泡过程中，窦腔边缘颗粒细胞逐渐凋亡，并引发后续一系列的颗粒细胞功能减退，最终导致卵泡闭锁。
2 颗粒细胞凋亡调控目前，对于颗粒细胞凋亡机制的研究，主要集中于凋亡相关的信号通路与凋亡相关的转录/转录后调控2个方面。
颗粒细胞的增殖和凋亡过程中，涉及以叉形头转录因子O(forkhead box O, FOXO)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, BCL-2)及凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)为代表的生存因子，以及以Fas/FasL、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)及p53等为代表的凋亡诱导因子，两类因子相互作用。相关细胞内信号通路受到卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、雌二醇、转化生长因子α(transforming growth factor-α, TGF-α)以及干细胞因子(stem cell factor, SCF)等多种激素、细胞因子的调控[4]。激素及各种细胞因子主要通过结合颗粒细胞表面受体，开启或关闭各种凋亡通路，实现对颗粒细胞凋亡的调控。
2.1 颗粒细胞的促凋亡调控通常认为，在颗粒细胞凋亡过程中，起到最主要作用的是Fas/FasL通路。颗粒细胞表面Fas表达水平在促性腺激素水平下降时明显升高，同时伴随细胞周期阻滞及p53表达升高[5]。Fas被激活后激活其相关死亡结构域(fas-associating protein with a novel death domain, FADD)，诱导caspase-8、细胞色素C等介导的细胞凋亡[6]。此外，TNF-α也可促进颗粒细胞的凋亡。TNF-α相关细胞凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis induced ligand, TRAIL)可以诱导体外培养的颗粒细胞凋亡，且这一凋亡途径可被caspase抑制剂阻断，而TRAIL在人卵巢各时期卵泡的颗粒细胞中均有表达[7]，提示TRAIL可能参与TNF-α介导的颗粒细胞凋亡以及卵泡闭锁。
2.2 颗粒细胞的抗凋亡调控PI3K/AKT信号通路在颗粒细胞抗凋亡中发挥关键的作用，其主要受到以FSH和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors -1, IGF-1)为代表的多种激素及生长因子的调控。PI3K/AKT信号通路通过影响FOXO1蛋白质的磷酸化，调节细胞周期蛋白D2(cyclin D2, CCND2)及抑制素α(inhibin-α, INHA)等基因的表达，促进颗粒细胞增殖、分化及生存[8]；而通过影响FOXO3磷酸化，阻止其对下游的Fas配体(FAS ligand, FASLG)及BCL-2样蛋白11(BCL-2-like protein 11, BCL2L11)的转录激活作用[9]，进而避免颗粒细胞的凋亡。
FSH作为一种重要的内分泌激素，与颗粒细胞上相应受体结合，促进优势卵泡的存活和生长。FSH主要通过刺激颗粒细胞的增殖、雌二醇分泌和上调细胞内抗凋亡蛋白[如X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)和FLICE样抑制蛋白(FLICE-like inhibitory protein, FLIP)]的表达来抑制细胞凋亡。XIAP通过抑制caspase-3、caspase-7及caspase-9而直接抑制颗粒细胞凋亡的发生[10]。FLIP主要通过抑制caspase-8的活性，直接从上游阻断经Fas及TNF-α介导的凋亡途径[11]。促性腺激素也可以上调颗粒细胞中XIAP及人凋亡抑制蛋白-2(human inhibitor of apoptosis protein-2, HIAP-2)的水平，从而发挥与FSH类似的抗颗粒细胞凋亡、阻止卵泡闭锁的作用[12]。
雌二醇作为性腺轴中的关键激素，由颗粒细胞分泌且可以作用于颗粒细胞自身。雌二醇在促性腺激素受体表达及卵泡生长的同时，也可以抑制颗粒细胞的凋亡。通常认为，雌二醇与其受体结合形成胞内复合物，作用于DNA上的雌激素反应元件，通过募集参与转录调控的其他因子，抑制p53及BCL-2相关蛋白X(BCL2-associated X, BAX)表达，阻止颗粒细胞的凋亡[13]。同时，雌二醇可以刺激TGF-α表达，而TGF-α通过促进XIAP的表达来促进颗粒细胞增殖并抑制其凋亡[14]。
此外，SCF在原始卵泡发育中起到至关重要的作用。SCF与膜受体c-kit结合，通过PI3K/AKT等信号途径，激活BCL-2家族成员，从而抑制颗粒细胞自噬及凋亡[15]。AKT的激活及FOXO的磷酸化有助于恢复环磷酰胺导致的颗粒细胞损伤，从而起到对环磷酰胺生殖毒性的缓解作用[16]。
总之，颗粒细胞凋亡的发生主要与促性腺激素以及FSH等激素水平的降低有关。这些激素缺乏会导致Fas激活及TNF-α等细胞因子介导的TRAIL表达增加，从而引起细胞内以caspase为主要途径的细胞凋亡。而雌激素、FSH及抑制素等可以发挥抑制颗粒细胞凋亡及促进颗粒细胞增殖的作用。雌激素、FSH等一方面通过激活PI3K/AKT信号通路，影响下游FOXO蛋白的磷酸化，间接抑制凋亡，另一方面通过抑制p53及BAX等基因的表达而直接抑制颗粒细胞凋亡。
3 颗粒细胞凋亡的转录后调控近几十年来对于转录后调控的研究，尤其是miRNA研究的快速发展，为生殖系统疾病研究带来了新的切入点。miRNAs是一类内源性的短非编码单链RNA，一般长度为18~24个核苷酸[17]。大多数mRNA转录物的成熟序列包含miRNA反应元件(miRNA response elements, MRE)，这提示miRNA在机体发育及生理病理过程中都起着关键作用[17]。目前证明，在哺乳动物卵泡形成和闭锁过程中，内源以及外源miRNA通过广泛参与转录后mRNA水平调控，在卵泡和黄体发育、卵巢功能[18]及卵巢疾病发生中[19]发挥关键作用。
其中，miR-1275最早被发现在癌症中能调控胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins, IGF2BP)的表达，最近研究证明miR-1275可通过靶向肝受体同源物1(liver receptor homologue-1, LRH1)影响雌二醇合成并导致GCs凋亡[20]。
Let-7(lethal-7)家族是最早发现的miRNAs之一，其功能包括促进细胞增殖、分化，组织发育和肿瘤抑制。最近发现，let-7家族成员在猪卵泡闭锁过程中差异表达。let-7a、let-7b、let-7c和let-7i的表达水平在早期卵泡和进行性闭锁卵泡中表达明显低于正常发育的卵泡，而let7-g在卵泡闭锁过程中高水平表达[21]。这表明let-7 miRNA家族组成了颗粒细胞凋亡的双向调节网络。与健康女性相比，早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者的let-7c下调[22]。
此外，miR-23a和miR-27a通过靶向SMAD5(drosophila mothers against decapentaplegic protein-5)促进人类颗粒细胞凋亡，而miR-92a、miR-181b和miR-182通过直接与SMAD7结合拮抗TGF-β而抑制细胞凋亡[17]。在POI患者中，miR-23a和miR-27a上调[22]。也有研究[23]表明，miR-23a和miR-27a直接靶向SMAD5后，通过Fas/FasL途径促进颗粒细胞凋亡。
4 颗粒细胞凋亡与女性生殖功能下降的关系目前普遍认为，大量颗粒细胞凋亡是卵细胞数目、受精能力下降的重要原因，凋亡颗粒细胞的比例也与体外受精的成功率负相关[24]。而大多数引起女性生殖功能异常的疾病，如脆性X染色体综合征(fragile-X premutation，FXPM)、POI、子宫内膜异位症及多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)等，均与颗粒细胞损伤有密切关系。在FXPM小鼠模型中，颗粒细胞因线粒体数目减少而功能异常，是造成雌性小鼠排卵数目减少及胚胎发育异常的重要原因[25]。
POI是指40岁之前卵巢功能停止，其发生受到自身免疫、遗传及化疗药物等多种因素的影响[26]。而POI与颗粒细胞的功能下降有关，主要表现为患者血清中抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)的水平下降[27]。而暴露于已知会引起氧化应激(OS)的环境，或应用γ辐射、化疗药物或多环芳烃(如环磷酰胺、二甲基苯)等药物，能激活颗粒细胞促凋亡信号，导致原始卵泡快速丧失，导致POI[28]。PCOS患者颗粒细胞的凋亡比例也明显升高，且凋亡的颗粒细胞中8-羟基-2-脱氧鸟苷明显升高，提示OS是诱导PCOS患者颗粒细胞凋亡的重要原因[29]。此外，OS可能是子宫内膜异位患者生殖能力下降的因素之一。
颗粒细胞凋亡是OS影响卵细胞功能及胚胎发育的关键因素，在多种生殖功能障碍中扮演重要角色。其中，谷胱甘肽的消耗是导致体内窦卵泡闭锁和体外培养的窦卵泡中颗粒细胞凋亡的重要原因[28]。
5 小结与展望随着对激素作用、细胞内信号通路、转录及转录后调控的研究，目前人们对颗粒细胞在卵泡发育中的重要作用、颗粒细胞状态对卵细胞功能及胚胎发育影响的认识正在不断深入，逐渐由宏观的病理组胚层面向更加精细的基因表达调控层面发展。对于相关激素在颗粒细胞凋亡中的作用，可以结合信号通路及miRNA等转录后调控进行分析，这有助于全新的生殖细胞发育调控图谱的发现。然而，如何通过干预信号通路来治疗疾病，仍需深入研究。例如，目前发现的POI相关的大量miRNA为该疾病的早期诊断提供了更多元的选择，但这些标志物的灵敏度以及特异度仍需要大量临床实验验证。
随着卵泡波理论的提出，对卵泡发育过程的整体化和连续化的认识也日益深入。然而，目前对优势卵泡选择所涉及的信号通路及转录后调控机制的认识仍不足。同时，颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的因果关系仍有争议。此外，颗粒细胞及卵细胞之间的跨区投影(transzonal projections, TZPs)起结构连接、物质传递及信号交流的作用，是形成卵泡最基本和最重要的结构基础及功能单位，而TZPs是否在颗粒细胞凋亡中发挥作用也无定论。虽然目前依靠相应动物模型，对颗粒细胞凋亡机制认识不断加深，但仍需结合临床，探究人卵巢颗粒细胞凋亡与疾病发生的关系，从而为临床上卵细胞功能评价、胚胎发育预测及生殖障碍相关疾病的治疗提供全新的方法与思路。
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