哮喘是常见的慢性非传染性疾病之一,全世界约有3.34亿人受其影响。自我报告或经医生诊断的成人哮喘在全球占4.3%,各国之间存在很大差异[1]。近年来,哮喘患病率在许多发达国家稳定或下降,但在发展中国家随着生活方式改变而迅速升高。长期接触过敏原,如病毒、烟雾、大气污染物和环境污染物,会增加患哮喘的风险[2]。哮喘的发病机制十分复杂,具有异质性,其病理基础为气道炎症,中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞在其中起重要作用。辅助T淋巴细胞2(Th2)细胞能合成高水平的白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13,导致过敏原特异性免疫球蛋白(Ig) E的产生和肥大细胞释放介质[3-5]。Th1细胞通过分泌干扰素(IFN)-γ抑制Th2免疫反应。因此,判断IgE的产生和Th1/Th2细胞因子的平衡是评价哮喘的重要工具。本研究对过敏性哮喘患者Th亚群进行分析,现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2018年1月至2019年9月于我院呼吸内科诊治的98例哮喘患者,男性49例,女性49例,年龄25~70岁,平均年龄(42.9±12.5)岁。按照2015版全球哮喘防治创议(global initiative for asthma,GINA)方案,将患者分为轻度组(n=31)、中度组(n=33)、重度组(n=34)。随机选择同期体检健康者为对照组(n=30)。组间年龄、性别等一般资料差异无统计学意义,具有可比性。
1.2 CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-4+T细胞百分比测定采集受试对象外周血2.4 mL,肝素抗凝,用PBS稀释成4 mL,混匀,然后沿试管壁缓慢加入4 mL淋巴细胞分离液Ficoll到液面之上,并保持清晰的分层状态。室温(18~20℃)离心2 000 r/min 30 min。离心后可见试管内的血液清楚地分为4层,上层为血浆层,中层为分离液层(单个核细胞处于血浆层和分离液层中间),底层为红细胞层,红细胞层上为粒细胞层。用吸管将上层与中层之间的单个核细胞吸出收集到另一试管中,用0.9%氯化钠液洗2遍,每次以1 500 r/min离心10 min,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液。单个核细胞悬液经佛波酯(PMA)和离子霉素刺激后,与CD4、IFN-γ、IL-4抗体(R&D;编号分别为FAB3791R-025、MAB285-SP、BAF204)室温孵育45 min,加入PBS洗涤、重悬,用Beckman Coulter Navios进行流式细胞检测。
1.3 高迁移率族蛋白-1 (high mobility group protein-1,HMGB-1)、IFN-γ、IL-4和IL-5测定采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(R&D)检测HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5(抗体编号分别为MAB1690-SP、DIF50、M4000B、M5000)表达,步骤均按照说明书,使用SynergyTM HT酶标仪(BioTek)在405 nm波长处检测吸光度值。
1.4 肺功能观察并记录受试者第1秒用力呼气容积(FEV1)。
1.5 统计学处理数据以x±s表示。采用SPSS统计软件包(Version 10.0)进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey检验,检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 受试者一般资料两组年龄、性别、体质量指数(BMI)等无明显差异;哮喘组血清IgE明显升高,FEV1明显降低(P < 0.05,表 1)。
指标 | 哮喘组(n=98) | 对照组(n=30) | P值 |
年龄(岁) | 42.9±12.5 | 42.5±11.8 | >0.05 |
性别(男/女) | 49/49 | 15/15 | >0.05 |
BMI(kg/m2) | 22.4±2.1 | 21.8±2.6 | >0.05 |
血清IgE(U/mL) | 172.1±14.6 | 15.8±10.2 | < 0.05 |
FEV1(mL) | 65.1±3.5 | 91.8±2.4 | < 0.05 |
BMI:体质量指数;FEV1:第1秒用力呼气容积 |
流式细胞术检测结果(图 1)显示:3组哮喘患者CD4+IFN-γ+ T细胞低于对照组(P < 0.05);哮喘患者CD4+IL-4+T细胞高于对照组(P < 0.05)。重度组患者CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-4+T细胞百分比与轻、中度组患者差异有明显统计学意义(P < 0.05)。
2.3 HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5表达水平结果(图 2)显示:哮喘患者HMGB-1、IL-4和IL-5表达水平明显高于对照组(P < 0.05),IFN-γ表达水平明显低于对照组(P < 0.05);重度组HMGB-1、IL-4和IL-5表达水平明显高于轻、中度组(P < 0.05),而IFN-γ表达水平明显低于轻、中度组(P < 0.05)。
2.4 HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5与肺功能的相关性Spearman分析结果表明,HMGB-1、IL-4水平与肺功能负相关(r=-0.568, P < 0.05;r=-0.572, P < 0.05),IFN-γ水平与肺功能正相关(r=0.685, P < 0.05),IL-5与肺功能无相关性(r=-0.258, P>0.05)。
3 讨论CD4+T细胞在哮喘患者机体控制炎症过程中起着至关重要的作用[6]。Th1、Th2、调节性T细胞(Treg)、Th17和滤泡辅助T细胞及其相关的细胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等均参与哮喘病理过程[7-9]。抗原激活的CD4+T细胞可分化为效应细胞,即Th1和Th2细胞。Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ、淋巴毒素,而Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-6[10]。Th2极化免疫反应参与哮喘的发生发展,而Th2细胞分泌的IL-4和IL-5在启动和维持哮喘反应中起重要作用。另一方面,由Th1细胞产生的IFN-γ可以预防过敏性哮喘[11]。本研究中,与对照组相比,哮喘患者Th1(CD4+IFN-γ+)细胞及其细胞因子IFN-γ表达水平明显降低,而Th2(CD4+IL-4+)细胞和其细胞因子IL-4、IL-5表达水平则明显升高。除此之外,IL-4、IFN-γ表达水平与疾病严重程度有相关性,疾病程度越严重,IL-4表达越高而IFN-γ表达越低。
HMGB1是哺乳动物细胞核中的转录因子。在炎症状态下,HMGB1可通过活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和树突状细胞等分泌到细胞外环境中。既往研究表明,在脓毒症、急性肺损伤和类风湿关节炎等急慢性炎症患者的血清中存在HMGB1,推测HMGB1可能是炎症中启动先天和适应性免疫反应的关键介质[12-14]。然而,HMGB1在过敏性哮喘中的确切作用尚不清楚。近年来,有研究发现HMGB1在急性哮喘患者痰和血浆中异常表达[15],是儿童过敏性哮喘的敏感生物标志物。本研究中,哮喘患者HMGB1表达明显高于对照组,而且与疾病严重程度正相关。
综上所述,本研究通过分析不同严重程度的哮喘患者以及健康成人外周血中Th1/Th2细胞和其相关细胞因子以及HMGB-1水平,发现过敏性哮喘患者血清中Th1/Th2失衡,HMGB1表达异常升高;HMGB-1、IL-4水平与病情严重程度密切相关,对临床治疗具有一定的评估作用。
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