2020, Vol. 27
2. 复旦大学附属中山医院医院感染管理科, 上海 200032
2. Department of Hospital Infection Management, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
曲霉菌在自然界中分布广泛，人类往往通过吸入曲霉分生孢子引起感染。由于宿主免疫状态不同，曲霉菌可引起各种临床综合征，包括侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis, CPA)和过敏性疾病等[1]。近年来，由于器官移植患者的增加、艾滋病患病率的快速增长和广谱抗菌药物、免疫抑制剂、糖皮质激素和抗肿瘤药物的大量使用，肺曲霉病的发病率和死亡率有增高趋势[2]。因此，早期识别和诊断此类疾病对改善预后具有重要意义。常规的CPA诊断主要通过从肺组织活检样本中检出曲霉孢子或菌丝作为确诊依据，或根据痰液、BALF等呼吸道样本的真菌培养结果进行诊断，但组织活检和真菌培养对检出肺曲霉病能力有限，且耗时较长[3]。
宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术作为一种新型的基因检测技术，理论上可快速、无偏倚地检测样本中所有病原体，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等，特别适用于罕见的、新现的和非典型的病原体[4-6]。研究[7-8]表明，mNGS在病原体的早期诊断方面具有较高的敏感性，并且不受抗感染药物的影响，是感染性疾病可靠的检测手段。本研究回顾性分析2017年9月至2019年9月复旦大学附属中山医院感染病科收治的78例疑似慢性肺曲霉病患者，采集样本进行mNGS、烟曲霉特异性抗体IgG检测和常规微生物培养，根据最终确诊结果评估mNGS在CPA诊断中的价值。
1 资料与方法 1.1 研究对象回顾性分析2017年9月至2019年9月复旦大学附属中山医院感染病科住院的78例疑似慢性肺曲霉病患者，同步采集样本进行常规微生物培养、血清烟曲霉特异性抗体IgG检测和mNGS，根据诊断标准确诊后分为CPA组(35例)和非CPA组(43例)。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会审核批准(No.B2017-193R)，所有患者均知情并签署知情同意书。
1.2 CPA的诊断标准CPA的诊断包括确诊和临床诊断，确诊标准根据欧洲临床微生物与感染性疾病学会和欧洲呼吸学会发布的慢性肺曲霉病的诊断和管理指南[9]以及美国感染病学会定义的诊断标准[10]，同时满足以下条件。
(1) 慢性肺部症状、慢性肺病或进展性影像学异常，如空洞、空洞周围浸润及真菌球；
(2) 没有或轻度的免疫功能损害，通常有一个或多个基础肺疾病；
(3) 曲霉IgG抗体升高或其他微生物学证据(如痰液、BALF或肺组织曲霉培养阳性、血清GM试验阳性、组织病理学见霉菌样菌丝)。
临床诊断指满足诊断标准中的第1条和第2条，但无曲霉感染的血清学、微生物学或病理学证据，临床医生在排除其他疾病后做出诊断，并且抗曲霉治疗后患者症状有好转。
1.3 常规微生物培养法将收集到的痰样本按照微生物接种方法接种于沙保罗琼脂培养基，将BALF样本接种于沙保氏葡萄糖琼脂培养基，置于25℃和35℃恒温培养箱中培养2~7 d，每天对菌落的形态和生长情况进行肉眼观察。
1.4 血清烟曲霉特异性抗体IgG检测采用酶联免疫法测定烟曲霉特异性抗体IgG，将稀释后的患者血清样本加到包被曲霉半乳甘露聚糖的酶标板中，血清中的曲霉IgG便与抗原结合，再加入抗人IgG酶标抗体和四甲基联苯胺产生显色反应，用酶标仪在450 nm波长下测定其吸光度，通过标准曲线计算样本中的曲霉IgG抗体浓度。烟曲霉特异性抗体IgG≥120 AU/mL，定义为阳性。
1.5 mNGS检测 1.5.1 样本处理和DNA提取取0.6 mL呼吸道样本(痰液、BALF、肺组织匀浆)，经玻璃珠混合震荡后使用TIANamp Micro DNA Kit (DP316, 天根生化科技有限公司，中国)试剂盒提取DNA。提取的DNA用作DNA文库构建。
1.5.2 文库构建和测序采用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，美国)质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片，采用BGISEQ-500进行测序。
1.5.3 数据分析测序数据下机后去除低质量的和长度小于35 bp的数据以获得高质量的数据。通过BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对，将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除，剩下的数据去除低复杂度reads后与专用的微生物大数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。
1.5.4 mNGS曲霉阳性定义以属严格序列数(SMRNG)或种严格序列数(SMRN)≥2为阳性界定值。
1.6 统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析。计量资料中的正态数据以x±s表示，非正态数据以M(P25, P75)表示。采用Pearson χ2检验、Fisher确切概率法或McNemer检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 一般资料结果(表 1)显示：2组患者年龄、性别和mNGS样本类型差异无统计学意义。送检的78例样本中，痰样本55例、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)样本17例、肺组织样本6例。35例CPA患者中，28例有基础疾病，其中，有肺结核史9例、有COPD和支气管扩张症9例、有近期糖皮质激素治疗史6例、有实体器官肿瘤4例、有非结核分枝杆菌感染史2例。
| 指标 | CPA组(n=35) | 非CPA组(n=43) | P值 |
| 年龄(岁) | 57.3±12.8 | 60.1±11.1 | 0.152 |
| 性别n(%) | 0.361 | ||
| 男 | 19(54.3) | 28(65.1) | |
| 女 | 16(45.7) | 15(34.9) | |
| 样本构成n | 0.748 | ||
| 痰 | 23 | 32 | |
| BALF | 9 | 8 | |
| 肺组织 | 3 | 3 |
结果(表 2)显示：以最终临床诊断(包括确诊和临床诊断)为金标准，mNGS的灵敏度和特异度分别为65.7%和86.0%，灵敏度高于烟曲霉特异性抗体IgG检测和常规微生物培养法，并且与常规培养法之间的差异有统计学意义(P=0.001)。
| 检测方法 | 灵敏度(%)(95%CI, n/N) | 特异度(%)(95%CI, n/N) |
| mNGS | 65.7(0.492~0.823, 23/35) | 86.0(0.953~0.968, 37/43) |
| 烟曲霉特异性抗体IgG检测 | 48.6(0.312~0.660, 17/35) | 90.7(0.817~0.997, 4/43) |
| 常规微生物培养 | 28.6(0.128~0.443, 10/35) | 93.0(0.851~1.000, 3/43) |
在CPA组中，仅通过临床诊断确诊的CPA患者有8例，其中4例(50.0%)患者mNGS结果阳性。培养阴性的CPA患者有25例，其中有14例(56.0%)患者mNGS阳性，12例患者烟曲霉特异性抗体IgG阳性。
2.3 诊断价值比较结果(图 1)显示：mNGS、烟曲霉特异性抗体IgG检测和常规微生物培养法的ROC曲线下面积(area under curve, AUC)分别为0.759、0.696和0.608，提示mNGS对诊断CPA的诊断价值更高。
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| 图 1 3种检测方法的ROC曲线 |
35例CPA患者样本中，痰样本、BALF样本和肺组织样本的mNGS阳性率分别为56.5%(13/23)、77.8%(7/9)和100%(3/3)，BALF的mNGS阳性率最高，但3种样本间差异无统计学意义(P=0.341)。
3 讨论CPA在全球范围广泛分布，其发病率逐年上升[11]。目前诊断CPA主要根据临床表现、影像学特征和提示曲霉感染的实验室结果综合判断，诊断非常困难[10]。本研究结果提示，对于诊断CPA，mNGS、烟曲霉特异性抗体IgG检测和常规培养的灵敏度分别为65.7%、48.6%和28.6%，mNGS的灵敏度最高，mNGS法优于常规培养法。Miao等[7]关于mNGS的回顾性研究表明，mNGS对诊断感染性疾病的灵敏度和特异度分别为50.7%和85.7%，特别是在结核分枝杆菌复合群、病毒、真菌和厌氧菌病原体中，mNGS的阳性率明显高于常规培养，并且检测结果不受早期抗菌药物暴露的影响。Li等[8]对mNGS检测肺组织感染性病原体的回顾性研究发现，与常规培养相比，mNGS具有检测时间短、灵敏度高的特点，可无偏倚地检测出苛养菌及厌氧病原体，其检测细菌的灵敏度和特异度分别为100%和76.5%，检测真菌的灵敏度和特异度分别为57.1%和67.5%。与本研究结果一致。mNGS检测方法的AUC高于烟曲霉特异性抗体IgG和常规培养，进一步说明mNGS对CPA诊断价值最高。
Miao等[7]的研究发现，在非结核分枝杆菌感染患者中，BALF样本中mNGS检测的阳性率高于痰样本，但在结核分枝杆菌、曲霉和隐球菌感染的患者中，痰样本、BALF样本和组织样本间的mNGS阳性率差异无统计学意义。本研究中，痰样本、BALF样本和肺组织样本的mNGS阳性率分别为56.5%、77.8%和100%，但三者间的差异无统计学意义，与既往研究结果一致。
烟曲霉特异性抗体IgG检测是机体对曲霉菌感染后出现的特异性免疫反应，检测患者血清中特异性IgG抗体可确定患者机体免疫状态，从而对肺曲霉病的临床诊断具有重要意义。IDSA指南也将烟曲霉特异性抗体IgG列为CPA的诊断标准之一。研究[12-13]表明，烟曲霉特异性抗体IgG检测诊断CPA的灵敏度可达75%~98%。但在本研究中，烟曲霉特异性抗体IgG的灵敏度仅为48.6%，可能与不同的研究中判断阈值不同及检测方法有关。而mNGS的灵敏度明显高于烟曲霉特异性抗体IgG检测法，二者之间的差异无统计学意义，可能与样本量较少有关。
真菌培养是诊断CPA的基本检测方法，根据不同的研究[13]报道，CPA患者的呼吸道样本真菌培养阳性率为11.8%~81.0%，同时由于曲霉可在气道定植，因此可造成一定的假阳性。本研究中，呼吸道样本培养诊断CPA的灵敏度仅为28.6%，显著低于mNGS。常规微生物培养和鉴定依赖于活的微生物的生长倍增速度，对于常见的细菌性病原体往往至少需要48 h，对于真菌至少需要7 d[14]。而mNGS可在采集样本后24~36 h内出具检测结果，大大缩短了检测时间，为感染性疾病特别是重症和疑难感染的诊断和治疗争取了时间。
本研究存在一些不足之处：(1)本研究为回顾性研究且纳入的病例数较少，因此关于mNGS在CPA中的诊断价值需要更大样本研究进一步证实；(2)由于GM试验对诊断CPA的灵敏度和特异度都较低[13]，本研究中的CPA患者GM阳性率仅为14.3%，且GM试验多用于侵袭性肺曲霉病的诊断，故未分析GM试验的灵敏度和特异度。
综上所述，在CPA的诊断中，mNGS的灵敏度显著高于常规培养法和烟曲霉特异性抗体IgG检测法，且在检测时间上优势明显。
| [1] |
SOUBANI A O, CHANDRASEKAR P H. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis[J]. Chest, 2002, 121(6): 1988-1999.
[DOI]
|
| [2] |
SCHELENZ S, BARNES R A, BARTON R C, et al. British Society for Medical Mycology best practice recommendations for the diagnosis of serious fungal diseases[J]. Lancet Infect Dis, 2015, 15(4): 461-474.
[DOI]
|
| [3] |
JHUN W B, JEON K, EOM J S, et al. Clinical characteristics and treatment outcomes of chronic pulmonary aspergillosis[J]. Med Mycol, 2013, 51(8): 811-817.
[DOI]
|
| [4] |
GOLDBERG B, SICHTIG H, GEYER C, et al. Making the leap from research laboratory to clinic:challenges and opportunities for next-generation sequencing in infectious disease diagnostics[J]. mBio, 2015, 6(6): e1815-e1888.
[PubMed]
|
| [5] |
GRAF E H, SIMMON K E, TARDIF K D, et al. Unbiased detection of respiratory viruses by use of RNA sequencing-based metagenomics:a systematic comparison to a commercial PCR panel[J]. J Clin Microbiol, 2016, 54(4): 1000-1007.
[PubMed]
|
| [6] |
SCHLABERG R, CHIU C Y, MILLER S, et al. Validation of metagenomic next-generation sequencing tests for universal pathogen detection[J]. Arch Pathol Lab Med, 2017, 141(6): 776-786.
[DOI]
|
| [7] |
MIAO Q, MA Y, WANG Q, et al. Microbiological diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing when applied to clinical practice[J]. Clin Infect Dis, 2018, 67: S231-S240.
[DOI]
|
| [8] |
LI H, GAO H, MENG H, et al. Detection of pulmonary infectious pathogens from lung biopsy tissues by metagenomic next-generation sequencing[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2018, 8: 205.
[DOI]
|
| [9] |
ULLMANN A J, AGUADO J M, ARIKAN-AKDAGLI S, et al. Diagnosis and management of Aspergillus diseases:executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline[J]. Clin Microbiol Infect, 2018, 24(v): e1-e38.
[URI]
|
| [10] |
PATTERSON T F, THOMPSON G R, DENNING D W, et al. Practice guidelines for the diagnosis and management of Aspergillosis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America[J]. Clin Infect Dis, 2016, 63(4): e1-e60.
[URI]
|
| [11] |
DENNING D W, PLEUVRY A, COLE D C. Global burden of chronic pulmonary aspergillosis as a sequel to pulmonary tuberculosis[J]. Bull World Health Organ, 2011, 89(12): 864-872.
[DOI]
|
| [12] |
PAGE I D, RICHARDSON M, DENNING D W. Antibody testing in aspergillosis——quo vadis?[J]. Med Mycol, 2015, 53(5): 417-439.
[DOI]
|
| [13] |
TAKAZONO T, IZUMIKAWA K. Recent advances in diagnosing chronic pulmonary aspergillosis[J]. Front Microbiol, 2018, 9: 1810.
[DOI]
|
| [14] |
SIMNER P J, MILLER S, CARROLL K C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases[J]. Clin Infect Dis, 2018, 66(5): 778-788.
[DOI]
|
