随着经济和卫生条件的改善及工业化进程的加快,国内感染性疾病谱已发生根本性改变,从病毒性肝炎逐步过渡到以细菌、真菌感染为主的疑难复杂感染症。非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria,NTM)作为除结核分枝杆菌以外的其他分枝杆菌类型,亚洲人群发病率已增长到约39.6例/十万人年,并且仍以每年19例/十万人年的速度增长[1]。在我国,NTM的发病率已逐渐超过结核病。前期临床数据[2]表明,约47%感染性疾病患者为分枝杆菌感染,而其中NTM约占50%,后者的发病率远远超出预期。同时,复旦大学附属中山医院NTM的确诊率仅为40%左右,据此推测二级医院及地方医院的诊断率可能更低。更为严峻的是,NTM感染具有用药方案复杂、疗程较长、疗效不佳、易复发等特点,成为比结核病更难治疗的疾病[3]。因此,精准快速的诊断是改善NTM感染临床预后的首要条件。
目前NTM感染的主要诊断方法仍为常规微生物培养法,但培养周期较长、培养阳性率低,为临床诊断带来挑战。宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术作为一种新型DNA/RNA测序方法,一方面,较一代测序方法通量更高、测序速度更快;另一方面,通过随机引物扩增样本中的所有核酸序列,理论上能无偏倚地检测出所有潜在病原体。因此,mNGS对于早期诊断疑难感染病例具有重大意义,在临床中的应用越来越广泛。本研究通过比较常规微生物培养法和mNGS检出NTM的阳性率,探讨mNGS技术对NTM的诊断效能。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2018年9月至2019年12月复旦大学附属中山医院收治的183例疑似NTM感染患者病例资料及388例样本。纳入标准:临床特征符合NTM诊断;样本质量合格;检测质控合格。排除标准:患者拒绝送检相关体液样本;样本质量不合格;同期样本未送检传统病原学检查或病理检测;测序结果示质控不达标。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(No.B2017-193R),所有患者均知情并签署知情同意书。
1.2 常规微生物学培养杆菌培养采用BACTEC MGIT960系统、改良罗氏法; 结核分枝杆菌复合菌与NTM分群主要采用对硝基苯甲酸(PNB)生长试验, 辅以耐热触酶试验、28∀生长实验。
1.3 mNGS检测 1.3.1 样本处理和DNA提取取0.5~3 mL患者痰液,经玻璃珠混合震荡后按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,天根生化科技有限公司,中国)试剂盒步骤提取DNA。
1.3.2 文库构建和测序采用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小,使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher,美国)对DNA文库浓度进行质控分析,经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片, 使用BGISEQ-500进行测序。
1.3.3 数据分析测序数据下机后去除低质量和长度小于35 bp的数据以获得高质量数据,通过比对,将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。去除低复杂度序列后与微生物大数据库比对,并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫进行分类排列。
1.3.4 mNGS阳性标准解读标准参照既往研究成果[2],通过覆盖度比例及排名界定阳性报告。灌洗液中,NTM属排名为前40以内,痰样本为前60,组织样本为前10。
1.4 统计学处理采用SPSS 10.0进行数据分析。采用McNemar检验比较阳性率。计量资料以±s表示,计数资料以n(%)表示,检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 一般资料结果(表 1)显示:183例NTM感染患者,共388例样本。其中男性92例,女性91例,平均年龄55岁。感染病科送检149例,占81.4%,其余送检科室分别为重症监护室、风湿科、呼吸科等。收治患者中,感染性疾病确诊患者为133例,占72.7%;在感染性疾病中,101例为肺部感染,占76.5%;感染性疾病的病原学确诊病例数为81例,占61.8%。
指标 | 结果 |
性别n(%) | |
男 | 92(50.3) |
女 | 91(49.7) |
年龄(岁)(x±s) | 55±13 |
送检科室n(%) | |
感染病科 | 149(81.4) |
门诊 | 9(4.9) |
重症监护室 | 8(4.4) |
风湿科 | 4(2.2) |
呼吸科 | 3(1.6) |
心外科 | 2(1.1) |
内部质控 | 2(1.1) |
骨科 | 1(0.5) |
泌尿外科 | 1(0.5) |
内分泌科 | 1(0.5) |
心内科 | 1(0.5) |
整形外科 | 1(0.5) |
肿瘤科 | 1(0.5) |
疾病类型n(%) | |
感染性疾病 | 133(72.7) |
非感染性疾病 | 21(11.5) |
不确定 | 29(15.8) |
感染性疾病类型n(%) | |
肺部感染 | 101(76.5) |
全身感染 | 16(12.1) |
皮肤软组织感染 | 3(2.3) |
淋巴结感染 | 3(2.3) |
尿路感染 | 2(1.5) |
浆膜腔感染 | 2(1.5) |
血流感染 | 1(0.8) |
心血管感染 | 1(0.8) |
五官感染 | 1(0.8) |
骨感染 | 1(0.8) |
腹腔感染 | 1(0.8) |
感染性疾病诊断类型n(%) | |
病原学确诊 | 82(61.8) |
临床诊断 | 51(38.2) |
结果(图 1)显示:388例样本中,通过常规培养法检测出NTM阳性为85例,占总例数的21.9%;mNGS检测NTM阳性为96例,占总例数的24.7%。2种方法总体阳性率差异无统计学意义(P=0.29)。96例mNGS阳性样本的检测周期为48 h,85例培养法阳性样本的平均检测周期为28 d,mNGS检测周期明显较短。
2.3 不同样本类型检测阳性率比较结果(图 2A)显示:388例样本中,各样本类型分布如下:组织90例,痰83例,肺泡灌洗液81例,血液64例,体液42例,其他28例。对于组织样本,培养法的阳性率明显低于mNGS检测法(7.8% vs 27.8%,P < 0.000 1);对于痰液样本,培养法的阳性率明显高于mNGS检测法(56.6% vs 22.9%,P < 0.000 1);而肺泡灌洗液,培养法和mNGS检测阳性率差异无统计学意义(30.9% vs 40.7%)。
样本类型 | 例数n | 阳性例数n(%) | ||
常规培养法 | mNGS法 | P值 | ||
组织 | 90 | 7(7.8) | 25(27.8) | 0.000 08 |
痰 | 83 | 47(56.6) | 19(22.9) | 0.000 05 |
肺泡灌洗液 | 81 | 25(30.9) | 33(40.7) | 0.13 |
血液 | 64 | 0 | 1(1.6) | 0.26 |
体液 | 42 | 13(30.1) | 11(26.2) | 0.5 |
其他 | 28 | 5(17.9) | 4(14.3) | 0.1 |
结果(图 2)显示:3个月的随访结果表明,mNGS 3个月内抗菌药物调整频率低于培养方法,差异有统计学意义(20.3% vs 40.2%,P < 0.05);患者抗NTM治疗有效率与培养法差异无统计学意义(40.7% vs 50.2%)。
3 讨论近年来,mNGS技术在感染病原学领域的应用价值受到了越来越多的关注和认可,宏基因测序由于其随机引物进行无差别的扩增,比传统检测方法具有更高的敏感性,是病原检测领域一项突破性的技术。目前,国内外针对此技术的临床应用已有初步成果[4-7],包括病例报道、病例系列报道、大样本研究等,涉及骨关节感染、皮肤软组织感染、肺部感染、中枢神经系统感染等,研究结果均表明,mNGS对病原体的检出效能较传统检测方法优势明显。因此,将来mNGS可能颠覆传统病原体检测流程,成为主导性诊断方法。目前研究重点需转移到此技术的改进流程及相关科研成果。
但是,前期研究[1]表明,mNGS在分枝杆菌的检测效能方面具有明显不足,而且非结核分枝杆菌mNGS的检出率和传统方法相比无明显优势。针对此现象,本研究采用2种方法检测NTM病例样本,结果表明,NTM和传统培养法阳性率均不足50%,总体灵敏度较低。可能是送检样本如血液、拭子等本身的检测阳性率就极低,因此总体阳性率偏低。基于上述结果,本研究认为NTM的病原学诊断依旧是临床实践中的难点,即使有了mNGS方法的应用,NTM的阳性率并没有明显提高,mNGS技术未来需要针对此病原体作重点改进。
另外,尽管mNGS和培养法在NTM病原体检出方面差异无统计学意义,但是将各类样本进行分层分析的结果表明,2种方法对肺泡灌洗液、痰液、组织这3种样本的检出阳性率差异明显。其中,痰液采用培养法检测的阳性率较高,而mNGS在肺泡灌洗液及组织检测中的阳性率较高。此结果与前期研究[1]相呼应,即mNGS检测NTM的理想样本为肺泡灌洗液和组织,而痰液样本可能由于大量口腔定植菌占绝大比例,间接导致NTM的序列检出数量明显下降,从而降低mNGS的灵敏度。
本研究结果表明,目前mNGS在鉴定诊断NTM这种病原体方面,与传统培养相比较,灵敏度无明显优势。但是在2种检测方法阳性率相当的情况下,mNGS能在24 h内明确NTM及菌种,而传统培养方法最长45 d报阳,菌种鉴定则更久。因此,本研究关于临床获益的统计表明,mNGS诊断为NTM的患者,3个月内抗生素调整频率低于培养组。另外,虽然2组患者的抗NTM时间及3个月内病灶好转率无明显差异,本研究认为造成此阴性结果的原因是本研究团队对NTM的影像学及临床特征认识比较深入,漏诊率低,诊治大多较及时,因此,后期可招募其他医院及中心的患者,更加客观评估mNGS的临床获益。
如何改进mNGS技术,提高NTM的检测阳性率?目前认为,增加数据量可增加mNGS的灵敏度,目前的数据量为每个样本30 M序列数,如果测序深度加大到100 M时,可能会使灵敏度趋于100%。但是,加大深度会带来另一个问题:如何判读所测到目标序列的真阳性或假阳性,在增加灵敏度的同时,是否会降低特异度?这是该技术未来需要探索的问题。
在现阶段的技术水平情况下,本研究认为对于疑似NTM感染患者,如果经济条件许可,推荐送检mNGS,在快速明确诊断并获得菌种信息的同时,揭示可能的合并感染。另外,对于肺部NTM感染拟诊患者,推荐的样本送检优先级别分别为肺泡灌洗液>肺组织>痰液,送检痰液时尽量送检深部晨痰以提高阳性率。
本研究尚有不足之处,病例未进行NTM的PCR检测,目前NTM的核酸检测相对成熟,因此可以和培养法相互补充,提高检测阳性率。因此,如果改进传统方法检测流程,可使入组患者例数增多,研究结果及数据更具客观性。
综上所述,mNGS是一项具有前景的研究,但是在NTM的病原学检测领域尚有很多不足,需重点改进以促进此技术更好地应用于临床。
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