2. 复旦大学附属中山医院感染病科, 上海 200032;
3. 复旦大学附属中山医院医院感染管理科, 上海 200032
2. Department of Infectious Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. Department of Hospital Infection Management, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
细菌耐药已成为威胁全球公共卫生的一大难题,全国CHINET数据[1]显示,2005—2018年耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)的比例持续上升,尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率上升幅度超过8倍,给临床治疗带来极大挑战。Idelevich等[2]在2018年首次采用基于MALDI Biotyper系统的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)直接靶板微滴生长法(direct-on-target microdroplet growth assay,DOT-MGA)快速检测美罗培南的耐药性,该方法快速、通量大,近年来迅速发展。本研究首次使用VITEK MS系统,并对现有DOT-MGA方法做出改进,选择的菌株为CRE中最常见且分离率最高的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,选择亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种临床常用的碳青霉烯类药物,评估DOT-MGA快速鉴别CRE的准确性。
1 材料与方法 1.1 菌株来源收集复旦大学附属中山医院微生物实验室2015—2019年非重复菌株,大肠埃希菌32株,其中耐碳青霉烯类大肠埃希菌(carbapenem-resistant Escherichia coli,CRECO)20株;肺炎克雷伯菌28株,其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)16株。
1.2 仪器和试剂VITEK MS质谱仪、VITEK MS-CHCA基质液(α-氰基-4-羟基-肉桂酸)及VITEK MS靶板购自法国生物梅里埃公司。Phoenix ID Broth及PhoenixSpec比浊仪购自美国BD公司。亚胺培南、美罗培南、厄他培南药敏试剂及CAMHB肉汤(阳离子调节MH肉汤)购自温州康泰生物科技有限公司。哥伦比亚血琼脂平板购自上海科玛嘉微生物技术有限公司。
1.3 微量肉汤稀释法菌株接种哥伦比亚血琼脂平板,(35±1)℃孵育18~24 h后备用。挑取新鲜纯菌落于Phoenix ID Broth中,采用PhoenixSpec比浊仪调制0.5麦氏浊度菌悬液,并用CAMHB肉汤进行1:200稀释,使菌液终浓度为5×105 CFU/mL。将稀释后的菌液分别接种于亚胺培南、美罗培南和厄他培南药敏试剂板条(3种药物浓度范围均为0.125~256 μg/mL),(35±1)℃孵育16~20 h后按试剂说明书判读3种药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),结果解释参照CLSI 2019年M100文件。用大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853(购自上海市临床检验中心)作为质控菌株。
1.4 DOT-MGA用新鲜纯菌落配制0.5麦氏浊度菌悬液,与CAMHB肉汤1:100稀释,使菌液浓度为1×106 CFU/mL。用CAMHB肉汤稀释药敏试剂板条中的抗菌药物,静置30 min使其充分溶解,调节药物浓度至亚胺培南4 μg/mL、美罗培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL。将3 μL菌液和3 μL药物溶液混合于VITEK MS靶板孔内作为检测孔,形成终体积为6 μL的微滴,同时用3 μL菌液和3 μL不加抗菌药物的CAMHB肉汤混合作为生长对照孔。检测孔和生长对照孔的菌液终浓度为5×105 CFU/mL,药物终浓度为亚胺培南2 μg/mL、美罗培南2 μg/mL、厄他培南1 μg/mL。为防止微滴在孵育过程中挥发,需将靶板置于湿盒中,(35±1)℃分别孵育3 h、4 h、5 h和6 h。将生长对照孔的成功鉴定率作为生长对照有效率,简称有效率。通过DOT-MGA与微量肉汤稀释法结果的比较,计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值4个指标,评估DOT-MGA 4个孵育时间的结果准确性。
1.5 VITEK MS质谱鉴定取出孵育完成的靶板,用移液器每孔吸去5 μL液体,残留液体用加热板60℃烘干。按照VITEK MS质谱仪标准化操作流程,将大肠埃希菌ATCC 8739(由法国生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校准点位,所有检测孔加1 μL VITEK MS-CHCA基质液,干燥后上机获取蛋白图谱。比较该图谱与数据库(SARAMIS MS-RUO v4.15.0)已知图谱,经软件(SARAMIS Premium v2.9.3)分析得出最终鉴定结果。
1.6 结果判定标准软件评估鉴定可信度在75.0%~99.9%时,视为有效的鉴定结果;鉴定可信度<75.0%时,无鉴定结果。当生长对照孔成功鉴定到种水平,即鉴定结果与目标菌一致且鉴定可信度在75.0%~99.9%时,DOT-MGA结果判定为有效,反之无效。在结果有效的条件下,由于微滴中的3种碳青霉烯类药物浓度为CLSI 2019年M100文件中规定的中介折点浓度,若检测孔成功鉴定到种水平,说明细菌在该浓度的抗菌药物环境中生长,视为耐药;若检测孔无鉴定结果,说明细菌在该浓度的抗菌药物环境中不生长,视为不耐药(敏感或中介)。
1.7 统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析。采用连续校正χ2检验比较有效率。采用Kappa检验评价DOT-MGA与微量肉汤稀释法结果的一致性。Kappa等于1认为两者完全一致;1>Kappa≥0.75认为一致性较好;0.75>Kappa≥0.4认为一致性一般;Kappa<0.4认为一致性较差。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 菌株MIC值分布结果(表 1)显示:微量肉汤稀释法检测所有菌株的亚胺培南、美罗培南和厄他培南的MIC值。
抗菌药物 | MIC值(μg/mL) | 大肠埃希菌(32株) | 肺炎克雷伯菌(28株) | |||
敏感(12株) | 耐药(20株) | 敏感(12株) | 耐药(16株) | |||
亚胺培南 | MIC范围 | 0.125~1 | 8~256 | 0.125~2 | 32~256 | |
MIC50 | 0.25 | 32 | 0.5 | 64 | ||
MIC90 | 0.5 | 128 | 2 | 256 | ||
美罗培南 | MIC范围 | 0.125 | 4~256 | 0.125~1 | 64~256 | |
MIC50 | 0.125 | 64 | 0.125 | 128 | ||
MIC90 | 0.125 | 128 | 0.5 | 256 | ||
厄他培南 | MIC范围 | 0.125~0.25 | 8~256 | 0.125~1 | 128~256 | |
MIC50 | 0.125 | 64 | 0.125 | 128 | ||
MIC90 | 0.25 | 128 | 0.5 | 256 |
结果(表 2)显示:肺炎克雷伯菌孵育至4 h时,有效率为92.9%(26/28),DOT-MGA检测3种碳青霉烯类药物的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100.0%,而有效率在孵育5 h后也达到100.0%。由于4 h和5 h的有效率差异无统计学意义(P=0.471),判断4 h是DOT-MGA鉴别CRKP的最佳孵育时间。
N=28 | |||||||||||||||||||||||||||||
孵育时间/h | 抗菌药物 | 有效率(%) | 灵敏度(%) | 特异度(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) | |||||||||||||||||||||||
3 | 亚胺培南 | 60.7 | 37.5 | 100.0 | 100.0 | 64.3 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 64.3 | 87.5 | 100.0 | 100.0 | 90.9 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 67.9 | 66.7 | 100.0 | 100.0 | 76.9 | ||||||||||||||||||||||||
4 | 亚胺培南 | 92.9 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 92.9 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 92.9 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||||||||||||||||||||||||
5 | 亚胺培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||||||||||||||||||||||||
6 | 亚胺培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
结果(表 3)显示:大肠埃希菌孵育至5 h时,有效率达100.0%,DOT-MGA检测3种碳青霉烯类药物的特异度和阳性预测值均为100.0%,亚胺培南的灵敏度为85.0%(17/20)、阴性预测值为80.0%(12/15);美罗培南的灵敏度为70.0%(14/20)、阴性预测值为66.7%(12/18);厄他培南的灵敏度为95.0%(19/20)、阴性预测值为92.3%(12/13)。因其孵育至6 h的结果准确性无进一步提升,判断5 h是用DOT-MGA鉴别CRECO的最佳孵育时间。
N=32 | |||||||||||||||||||||||||||||
孵育时间/h | 抗菌药物 | 有效率(%) | 灵敏度(%) | 特异度(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) | |||||||||||||||||||||||
3 | 亚胺培南 | 46.9 | 44.4 | 100.0 | 100.0 | 54.5 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 40.6 | 12.5 | 100.0 | 100.0 | 41.7 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 43.8 | 22.2 | 100.0 | 100.0 | 41.7 | ||||||||||||||||||||||||
4 | 亚胺培南 | 100.0 | 80.0 | 100.0 | 100.0 | 75.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 100.0 | 60.0 | 100.0 | 100.0 | 60.0 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 100.0 | 75.0 | 100.0 | 100.0 | 70.6 | ||||||||||||||||||||||||
5 | 亚胺培南 | 100.0 | 85.0 | 100.0 | 100.0 | 80.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 100.0 | 70.0 | 100.0 | 100.0 | 66.7 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 100.0 | 95.0 | 100.0 | 100.0 | 92.3 | ||||||||||||||||||||||||
6 | 亚胺培南 | 100.0 | 85.0 | 100.0 | 100.0 | 80.0 | |||||||||||||||||||||||
美罗培南 | 100.0 | 70.0 | 100.0 | 100.0 | 66.7 | ||||||||||||||||||||||||
厄他培南 | 100.0 | 95.0 | 100.0 | 100.0 | 92.3 |
将2种肠杆菌科细菌在最佳孵育时间的DOT-MGA结果与微量肉汤稀释法进行一致性分析结果:肺炎克雷伯菌3种碳青霉烯类药物的DOT-MGA结果与微量肉汤稀释法完全一致(Kappa=1),大肠埃希菌则表现为亚胺培南和厄他培南的一致性较好,且厄他培南(Kappa=0.93)优于亚胺培南(Kappa=0.81),美罗培南一致性一般(Kappa=0.64)。
3 讨论CRE感染与高死亡率密切相关,特别是CRE血流感染,其死亡率是非CRE血流感染的2~3倍[3]。快速鉴别CRE有利于临床早期正确选择抗菌药物,降低患者死亡率。传统药敏试验需16~20 h,耗时长;PCR法快速检测CRE只能识别特定、已知的碳青霉烯酶[4],对非产碳青霉烯酶机制或未知碳青霉烯酶导致的耐药则无法检测,且该方法对实验室和人员要求高,仪器价格昂贵;Carba NP试验同样只能检测产碳青霉烯酶的CRE,且操作复杂,人为判读结果可能会有误差。采用MALDI-TOF MS快速鉴别CRE现有3种方法[5]:(1)检测菌株与碳青霉烯类药物作用一段时间后的水解产物;(2)直接检测菌株的碳青霉烯酶质谱特征峰;(3)通过DOT-MGA评估菌株的MIC值,其中第1种和第3种方法可解决上述问题。
本研究选用DOT-MGA,参考Idelevich等[6]得出的最佳微滴体积6 μL,首次采用VITEK MS系统代替MALDI Biotyper系统,并对现有方法做出了改进。其文章中使用特殊材质的纸巾通过毛细管效应去除孵育后靶板上的微滴。由于该材料不易获得,预实验时选用普通纸巾替代,但发现其吸水性不佳且会引起相邻孔位的污染。故本实验采用移液器吸去等量液体再用加热板烘干的方式,实验前期尝试了吸去4.5 μL、5 μL和5.5 μL 3种方案,最终发现吸去5 μL液体的效果最好。
本研究主要评估了DOT-MGA在4个孵育时间点鉴别CRECO和CRKP的结果准确性。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在孵育3 h时的有效率为40.6%~67.9%,且DOT-MGA结果的重复性和准确性较差,不推荐作为常规检测方案。大肠埃希菌孵育5 h、肺炎克雷伯菌孵育4 h时DOT-MGA结果的准确性已达4个孵育时间的最高值,延长孵育至6 h,质谱的鉴定可信度虽略有提升,但最终结果并无变化。
本研究中的28株肺炎克雷伯菌在孵育4 h时,仅有2株黏液性菌株生长对照孔无鉴定结果,其余菌株的DOT-MGA结果与微量肉汤稀释法完全吻合,说明采用DOT-MGA鉴别CRKP的准确性高。在大肠埃希菌用此方法检测时,发现部分CRECO的假阴性,3种碳青霉烯类药物中厄他培南的准确性最高。20株CRECO在孵育5 h时,有3株亚胺培南、6株美罗培南、1株厄他培南的DOT-MGA结果为不耐药,但在延长孵育时间至18 h后全部耐药,可能由于某些碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物的速度较慢,且不同碳青霉烯类药物的作用位点及抗菌活性也有差异[7],短时间孵育的菌量尚达不到质谱检测的阈值,需要延长孵育时间才能得到准确的检测结果。本研究的菌株数量不多,且菌株的MIC值分布不均,实验结果可能有一定局限性,未来需加大菌株量来进一步完善。
DOT-MGA具有快速、原理简单、操作方便、实用性强等优点,运用相当广泛,除了鉴别CRE之外,还可检测其他菌株类型及其他抗菌药物的耐药性。有研究[8]使用该方法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,或通过加和不加酶抑制剂的DOT-MGA结果差异进行ESBLs及AmpC酶的检测[9]。此外,报阳后的血培养标本通过过滤、洗涤、离心等前处理,将富集的病原菌直接进行DOT-MGA检测,可在数小时内获得特定药物的耐药性结果与菌株鉴定结果[10]。然而DOT-MGA作为一种新方法,其标准化和重复性有待考察,未来或许可以通过引入自动化系统或制造商品化药物冻干粉包被的靶板来解决这一问题[11]。另外,DOT-MGA现仍处在研究的起步阶段,仍需继续扩大菌株类型、增加菌株数量、探索实验方案,来验证现有方法的可靠性和重现性,并继续扩展其在快速药敏检测领域的运用。
综上所述,采用MALDI-TOF MS的DOT-MGA法鉴别CRE,快速、准确、操作简便,特别是检测CRKP的准确性高,可为临床早期的抗菌药物靶向精准治疗提供帮助。
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