2020, Vol. 27
2. 延边大学医学院, 延吉 133002
2. College of Medicine, Yanbian University, Yanji 133002, Jilin, China
骨质疏松症(osteoporosis, OP)是由多种原因导致的以骨量和骨密度显著降低、骨微结构退化或破坏为主要特点，骨组织脆性增加而易于发生骨折的全身性骨病[1-2]。老年OP患者常因骨脆性增加导致骨折，患者又常因股骨颈骨折、膝、髋关节炎和类风湿性关节炎等原因接受关节置换或其他骨植入性手术。研究[3]发现，OP的骨量减少和骨微结构退化会影响植入假体-骨结合面的稳定性，如果在骨整合过程中没有恰当处理，低骨量和骨微结构的退变会进一步影响内植体的固定，所以骨质疏松是植入物失败的主要危险因素之一[4]。
而绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是常发于绝经后妇女，由于雌激素缺乏而引起的一种骨代谢异常疾病，其特点是骨量和骨密度降低，骨微结构退化或者破坏。近年来研究[3]提示，PMOP患者关节内植入假体常易发生无菌性松动。随着世界人口的老龄化，OP日益成为一个主要的、不断升级的医疗关注问题。尽管临床研究证实OP不是植入物植入的禁忌证，但如果在骨整合过程中没有适当的治疗，低骨量和骨微结构的恶化会进一步阻碍植入假体的稳定性。因此，通过给予有效的药物治疗等手段改善植入假体的骨整合效果势在必行。
抗骨吸收药物如阿仑膦酸钠(alendronate sodium)，虽能有效地保存骨量，却不能促进新骨形成[5-6]。合成代谢药物如甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)可促同化作用[7]，但随着时间的推移PTH在体内大量聚积，会导致大鼠种植体松动[8-9]。因此，使用抗骨吸收和合成代谢药物都不是最佳治疗方案。
近期研究[10-12]表明，雷尼酸锶(strontium ranelate，SR)有促进骨生成和抑制骨吸收功能的双重效应。SR的这一机制有望改善种植体的骨整合，特别是在OP或低骨密度的机体内。因此，本研究建立双侧卵巢切除(OVX)，然后构建骨质疏松大鼠假体植入的动物模型，并进行SR灌胃处理。治疗12周后，先后利用生物力学测试、组织学观察及组织形态计量学的方法评估植入假体的骨整合情况，以探讨SR对OVX大鼠植入假体钛骨整合效果的影响，进而为SR对PMOP患者植入假体的临床治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 1实验动物选取雌性SD大鼠40只，体质量200~220 g，由复旦大学附属中山医院实验动物中心提供。OVX模型预实验10只，剩余30只随机分为治疗组(15只)和对照组(15只)。饲养条件：自由进食饲料，饮用水消毒，湿度55%，室温(24±1)℃，自动通风系统，紫外线消毒。本研究经本院动物伦理委员会批准。
1.2 OVX模型的预实验和Micro-CT分析利用0.3 mL/kg速眠新Ⅱ和35 mg/kg氯胺酮对大鼠肌注麻醉成功后，首先背部剃毛，碘伏消毒。自后方髂骨嵴上约2 cm、脊柱旁约1~1.5 cm处取一纵行切口，长1~1.5 cm。逐层切开皮肤、皮下和肌肉，暴露腹腔，分离软组织。按切除或者不切除双侧卵巢将大鼠分成OVX组和假手术(Sham)组(每组5只)：OVX组对双侧切除的卵巢残端进行结扎，避免出血，再逐层缝合，关闭伤口；Sham组只是暴露双侧卵巢，然后将卵巢回纳腹腔，关闭伤口。
术后8周，动物取材，采用台式Micro-CT系统(eXplore Locus SP，GE Healthcare，美国)评估OVX组和Sham组大鼠右股骨的骨显微结构，验证OVX模型构建是否成功。扫描股骨并重建图像达到12 μm的像素大小。股骨的远侧部分在圆柱形样品架中垂直于扫描轴并对齐，总扫描长度为10 mm。使用半自动轮廓算法在轴向平面从皮层中分离出干骺端的骨小梁。选择距干骺端线1 mm和上方50个连续切片的目标体积(VOI)进行数据分析。所有3D图像操作和分析均在系统软件(MicroView，v.2.1)中进行。主要分析的结构参数：骨小梁间距(Tb.Sp)，骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接密度(Conn.D)和结构模型索引(SMI)。
1.3 骨植入物模型的建立、分组和SR给药待预实验成功后，正式建立30只大鼠OVX模型，再建立骨植入模型。将大鼠麻醉成功后，双下肢内侧剃毛。碘伏消毒，经髌骨旁内侧入路暴露膝关节，1.5 mm克氏针在双侧胫骨结节处垂直胫骨长轴钻一骨道，之后植入钛假体(1.5 mm×7 mm)，置入钛假体深度约7 mm，最后，缝合手术切口。为了预防术后感染，予以青霉素肌注处理，使用剂量为200 U/kg，共3 d。
术后大鼠笼内自由活动，并分为对照组和治疗组，每组15只。治疗组每天给予SR(天津思维雅制药有限公司，中国)400 mg/kg灌胃，对照组每天给予同等容量的0.9%生理盐水灌胃处理。
1.4 模型建立后处理所有大鼠灌胃给药12周后颈椎脱臼处死，取胫骨上段，剔净软组织，4%多聚甲醛固定。甲基丙烯酸甲酯包埋，50 μm厚硬组织切片。然后行苦味酸品红染色，采用Free Max 3.0半自动图像分析软件选取硬组织切片图片需要测量区域，软件自动计算植入假体周围新生骨的接触面积比率和植入假体周围新生骨面积均值。
1.5 假体推出压力实验将胫骨用生理盐水纱布包裹，低温保存，以维持胫骨的韧度，样本长度为大鼠胫骨全长。牙托粉固定做力学测试，骨植入面保持水平位，远端用牙托粉固定于力学测试机上，进行生物力学测试。
利用生物力学试验机对胫骨标本予压缩载荷，在压缩试验中，首先给予胫骨标本10 N的载荷力2次，其速度为1 mm/min，完全卸载后再观察是否归零，再给加载100 N的力1次，以观察最大载荷。失效标准：(1)出现继发骨折；(2)高峰后无平台期的下降；(3)移位＞3 mm。
1.6 假体推出剪切力强度实验利用生物力学试验机对样本予以剪切力实验。剪切强度(r)=压力(F)/骨与植入体的接触面积(S)。
1.7 组织形态计量学对硬组织标本切片进行观察，评定植入假体周围纤维界膜的情况，植入假体与周围新生骨的接触面积，还有植入假体周围新生骨的面积。
1.8 统计学处理采用SPSS 20.0进行数据处理。计量资料以x±s表示，采用t检验和χ2检验对Micro-CT分析的骨参数、假体置入物与周围新生骨接触面积比率、植入假体周围新生骨面积的相对均值、压力与剪切强度均值进行统计学分析。检验水准(α)为0.05或0.01。
2 结果 2.1 OVX预实验模型成功构建结果(图 1)显示，OVX组和Sham组之间的骨小梁显微结构存在差异。手术后8周，与Sham组相比，OVX处理的标本显示出更少、更薄的骨小梁和更多的骨小梁断裂(图 1A)。OVX大鼠骨微结构参数(Conn.D，BV/TV，Tb.N和Tb.Th)较Sham组均降低(图 1B、C、E、F，P < 0.05)。相反，OVX组股骨中的SMI值与Sham组相比明显增加(图 1D, P < 0.05)。以上数据提示OVX模型构建的预实验成功，可直接建立正式OVX模型。
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| 图 1 OVX模型大鼠的Micro-CT分析 A：股骨干骺端骨质的矢状位和3D重建后图片; B: Conn.D的定量分析; C:BV/TV的定量分析; D: SMI的定量分析; E:Tb.N的定量分析; F: Tb.Th的定量分析. *P < 0.05与Sham组比较 |
30只OVX大鼠经手术后存活良好，无感染发生。在假体植入手术后，对照组1只大鼠左腿胫骨近端发生骨折，最终骨折部位骨痂愈合，植入假体没有观察到明显的骨结合，其数据最终未纳入统计。剩余其他对照组与治疗组中OVX大鼠的植入假体与周围新生骨结合比较紧密。2.3生物力学测试结果(表 1)显示，治疗组与对照组假体的植入物压力和剪切强度差异有统计学意义(P < 0.01)，提示大鼠用SR治疗后可以增强假体植入物的力学强度。
| N=8 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 推出压力值 (N, x±s) |
P值 | 推出剪切力强度 (N，x±s) |
P值 | |||||||||||||||||||||||||
| 治疗组 | 201.131±38.143 | ＜0.01 | 421.131±71.192 | ＜0.01 | |||||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 87.661±16.994 | ＜0.01 | 198.661±37.912 | ＜0.01 | |||||||||||||||||||||||||
结果(表 2)显示，植入假体周围新生骨接触面积比率和假体周围新生骨面积与对照组相比，差异具有统计学意义(P < 0.01)，提示OVX大鼠用SR治疗后可以显著提高假体植入物的骨整合效果。
| N=8 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 接触面积比率 (%，x±s) |
P值 | 新生骨面积的相对值 (%，x±s) |
P值 | |||||||||||||||||||||||||
| 治疗组 | 98.1±11.2 | ＜0.01 | 93.1±9.6 | ＜0.01 | |||||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 49.7±9.1 | ＜0.01 | 47.8±8.5 | ＜0.01 | |||||||||||||||||||||||||
结果(图 2)显示，治疗组和对照组植入假体周围都是由软组织纤维界膜、新生骨构成。治疗组植入假体周围的软组织纤维界膜十分稀少，新生骨与植入假体界面多为直接接触，有些部位新生骨与假体界面可达到完全整合。而对照组的植入假体周围纤维界膜明显较多、较厚，植入的假体与新生骨界限清晰。
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| 图 2 治疗组和对照组硬组织切片染色结果 A、B:治疗组硬组织切片染色结果；C、D:对照组硬组织切片染色结果. “*”:假体钛; “#”：新生骨. Original magnication:×40(A、C), ×200(B、D) |
种植牙及骨科内植物手术已成为多种疾病治疗的首选方案[13-16]。口腔种植牙和骨科中骨内植物的长期稳定性非常关键[17]，主要取决于植入假体与骨的接触面积、植入假体周围的骨量以及植入假体的生物相容性，生物相容性不作为本研究重点。而OP患者内植物周围骨吸收过度，骨形成低，从而骨面产生空洞、支撑降低，易导致内植物失效。而采取药物进行干预成为降低骨质疏松影响的方法之一，而SR作为一种常用药物受到关注。
内植物植入体内后，骨经历一个初始的重塑阶段，其主要特征是破骨细胞活性增加。而人体研究[18-19]表明，SR可减少破骨细胞形成和骨吸收，刺激成骨细胞分化。因此，SR的这种药物特性有助于改善骨整合。文献[20-21]报道，国内、外多采用每天400~625 mg/kg的SR行灌胃6~12周用于OVX大鼠的实验研究。本研究表明，通过对OVX大鼠进行每天400 mg/kg的SR灌胃处理12周，内植入假体周围骨接触面积增加以及内植物周围骨量增加。而通过推出力检测可评估内植物骨整合的情况，其主要取决于骨质量或体积、内植物周围骨接触面等因素[22]。本研究中，与对照组相比，SR治疗组诱导更多板状骨，提高了骨小梁厚度和数量和内植入假体周围骨接触的相对骨面积，增加了假体的推出强度。这些数据证明，SR对内植物骨整合存在影响，提示了SR在骨科和种植牙医学中对内植体骨整合的潜在益处。
但本研究观察到的只是骨量的增加、骨微结构的改善和种植体内固定的增强，并未具体分析SR分别对破骨细胞和成骨细胞的双重作用机制。而且，由于大鼠12周的观察时间过长，此时骨整合过程可能已经完成。因此，本研究结果仅显示SR对OP种植体骨整合的影响，不能提供关于SR对内植物植入后早期骨反应的信息。其次，OVX大鼠OP模型与绝经后妇女的生理状态仍存在不同，无法与临床上的OP患者发病过程完全相符。鉴于本研究的不足之处，将采用更加符合临床应用的模型及材料进行进一步研究，为OP患者的植入物手术治疗提供更科学的实验依据。
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