2020, Vol. 27
2. 同济大学附属东方医院心胸外科, 上海 200120;
3. 同济大学医学院, 上海 200092
2. Department of Cardiothoracic Surgery, Shanghai East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China;
3. School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200092, China
心梗导致的心室重构是诱发心衰的重要因素[1]。随着早期再灌注理念的发展以及介入治疗的不断深入，急性心梗导致的死亡率已明显降低。尽管如此，10%~25%的心梗患者仍于5年内因心衰失去生活能力[2]。早期再灌注治疗可以减轻心肌缺血的损伤程度。但再灌注在改善心肌供血的同时加重了单纯缺血本身所造成的心肌损伤，可进一步导致心律失常、梗死面积增大、持久性心室收缩功能低下等状况，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI)。MI/RI是心梗患者发生心室重构，并最终进展为心衰的主要原因。因此，深入探讨MI/RI后心室重构的发生机制，可为有效控制心梗患者病死率，以及心衰的发生率提供重要的实验依据。
血小板来源生长因子(platelet-derived-growth-factor, PDGF)是一种最初从血小板α颗粒中发现的生长因子，PDGF家族配体由4种亚基-A，-B，-C，-D组成，其可构成PDGF-AA，-BB，-CC和-DD的同源二聚体和PDGF-AB异源二聚体。PDGF通过2种不同亚型的酪氨酸激酶相关受体PDGF Receptor(PDGFR)-α和-β发挥其生物学活性，并在心肌细胞及成纤维细胞表面表达[3]。近期研究[4-5]发现，在大鼠心梗模型中，梗死心肌组织中PDGF的表达水平明显上调。此外，PDGF/PDGFR信号通路的激活可通过刺激成纤维细胞的增生和肌纤维母细胞的转化促进高血压诱发心肌纤维化。
CP-673, 451是一种新型PDGFR磷酸化高选择性抑制剂[6]，对PDGFR-α及PDGFR-β均可发挥抑制作用。本研究拟观察CP-673, 451是否可以通过抑制PDGFR的磷酸化，改善MI/RI后心室重构的过程，证实PDGF/PDGFR通路在MI/RI后心室重构中发挥的致病作用，并进一步探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 SD大鼠乳鼠心肌细胞分离及分组 1.1.1 心肌细胞提取心肌细胞分离：取SPF级1~2日龄SD大鼠，剪去头部，剪开胸腔，挤出心脏，置于平衡液中洗去心脏中的血液。将心脏转移至新的平衡液，剪去心房，把剩余心室组织剪碎约1 mm3的小块，再将心脏碎片转移至细胞温控搅拌器，加5 mL 0.175%胰酶及胶原酶Ⅱ，放在温控搅拌器上消化5 min(300 r/min，37℃)。将上清消化液转移至离心管中，加入10 mL NBCS终止消化，剩余心肌组织重复上述步骤，直至全部心脏组织消化完毕。将含有血清的细胞悬液1 800 r/min离心10 min，弃上清，10 mL培养基重悬。将提取的10 mL细胞悬液以2 mL/管缓慢沿管壁加入Percoll密度梯度溶液。将离心机的加速与减速均设为最低值，1 800 g离心30 min。离心管中液体分3层，第1层和第2层之间液体的细胞薄层为新生大鼠心肌成纤维细胞(neonatal rat cardiac fibroblasts, NCF)。吸出NCF加入5 mL缓冲液，1 000 r/min离心5 min，弃上清。最后，再用5 mL培养基重悬，制成细胞悬液，入二氧化碳培养箱中(37℃、5%CO2)培养。
1.1.2 实验分组分为空白对照组，PDGF-BB组(10 ng/mL)和PDGF-BB+CP-673, 451组(0.1 μmol/L)。
1.2 小鼠缺血再灌注(MI/RI)模型建立 1.2.1 实验动物及分组所有模型小鼠均采用8~10周雄性C57BL/6小鼠。分组如下：(1)假手术组(n=5)；(2)MI/RI组(n=5)；(3)用药组MI/RI+10 mg/kg CP-673, 451(n=5)。
1.2.2 MI/RI模型实验小鼠腹腔内注射戊巴比妥(80 mg/kg)进行麻醉。采用气管插管的方式人工通气(0.3 mL tidal volume, 120 breaths/min)。切开左胸第四肋间，暴露左前降支(用7-0缝合丝线穿过PE管，制成Rumel snare勒除器/套管以达到血流阻断)，用8-0尼龙缝合线距左心房心室间边界下2 mm(离左心房远端2 mm)处进行阻断30 min后，进行再灌注14 d。所有实验小鼠均缺血术后连续7 d腹腔注射PBS或CP-673, 451。第14天，对心脏进行心功能检测和Masson染色。
1.3 MI/RI后心功能及心室重构的评估 1.3.1 心功能检测对小鼠MI/RI手术前和手术2周后分别进行心脏超声(心超)检测，心超仪器为装备15 MHz线性探头的Acuson Sequoia C236。在心室中线水平短轴方向用M模式心超检测左心室功能。测量左心室舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs)，计算左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)，LVEF=(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3和缩短分数(fractional shortening, FS)的百分值，FS=[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd](%)。
1.3.2 心肌纤维化水平测定小鼠安乐死后，取出心脏固定于4%多聚甲醛，并用石蜡包埋。在心尖梗死水平得到横切面，并进行Masson染色，确定心肌纤维化程度。
1.4 炎症反应测定qPCR法测定心肌组织中相关炎症因子基因的表达。
1.5 胶原合成测定CP-673, 451(0.1 μmol/L)预刺激NCF 1 h后，加入PDGF-BB(10 ng/mL)，刺激6 h后，收取RNA。qPCR分析NCF中胶原合成基因的表达。
1.6 PDGF/PDGFR通路调节MI/RI后心室重构的机制探索PDGF刺激15 min后，收取NCF的蛋白。Western Blot分析信号通路中p38分子磷酸化的表达变化。
1.7 统计学处理数据均以x±s表示，使用SPSS 13.0统计软件进行分析。多组数据之间比较采用单因素方差分析。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 心功能变化MI/RI后14 d小鼠的心脏超声检测结果(图 1)显示，小鼠MI/RI后LVEF及FS均明显低于假手术组，CP-673, 451可显著改善这一变化，升高小鼠LVEF及FS；此外，CP-673, 451可降低MI/RI导致的收缩期左室内径LVID的升高(P＜0.05)，最终达到改善心功能的效果。
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| 图 1 CP-673, 451对MI/RI后小鼠心功能的影响 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.000 1 MI/RI组vs假手术组，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001用药组vs MI/RI组 |
病理学染色(Masson)结果(图 2)表明，与假手术组相比，MI/RI组心肌纤维化面积明显扩大(图 2蓝色区域)；与MI/RI组相比，用药组心肌纤维化面积明显缩小(图 2蓝色区域)。CP-673, 451可显著抑制MI/RI导致的心肌组织纤维化。
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| 图 2 CP-673, 451在MI/RI后小鼠心室重构中的作用 Original magnification: ×50 |
q-PCR结果(图 3)表明，与假手术组相比，小鼠MI/RI后梗死处心肌内炎症因子IL-1β，TNF-α，IL-6 mRNA表达水平显著增加(P＜0.000 1)，CP-673, 451可有效抑制上述炎症因子的表达(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.000 1)。
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| 图 3 CP-673, 451对MI/RI后小鼠心肌炎症因子表达的影响 ***P＜0.000 1 MI/RI组vs假手术组，##P＜0.01，###P＜0.001，####P＜0.000 1用药组vs MI/RI组 |
q-PCR结果(图 4)显示，在NCF中，CP-673, 451可以降低PDGF-BB导致的胶原Ⅰ(Col Ⅰ)(P＜0.05)及胶原Ⅲ(Col Ⅲ)的升高程度(P＜0.01)。
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| 图 4 CP-673, 451对PDGF-BB刺激的NCF中胶原合成基因的调控 **P＜0.01 PDGF-BB组与空白对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01 PDGF-BB+CP-673, 451组与PDGF-BB组相比 |
Western Blot蛋白条带结果(图 5A)显示，PDGF-BB刺激后p-p38蛋白条带明显加深，CP-673, 451可很大程度上减轻蛋白条带浓度。结果(图 5B)表明CP-673, 451可显著降低NCF中PDGF-BB刺激的p38蛋白磷酸化水平(P＜0.05)。
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| 图 5 p38/MAPK信号通路在CP673, 451及PDGF-BB处理后细胞中磷酸化水平分析 A：CP673, 451及PDGF-BB刺激后NCF中p-p38蛋白条带结果；B：p38蛋白磷酸化水平统计结果。**P＜0.01 PDGF-BB组vs空白对照组，##P＜0.01 PDGF-BB+CP-673, 451组vs PDGF-BB组 |
心梗导致的心室重构是诱发心衰的重要因素[1]。MI/RI是心梗患者发生心室重构，并最终进展为心衰的主要原因。MI/RI是一个多因素的复杂的病理生理过程，目前，MI/RI发生机制尚未完全阐明，但有大量研究[7-10]表明，MI/RI的发生可能与细胞内钙离子超载、氧自由基产生、能量代谢障碍、中性粒细胞等炎症细胞浸润及心肌细胞凋亡等因素密切相关。再灌注期间心肌收缩力增加导致的氧耗及能量需求增加，炎症反应造成的心肌组织损伤，在促进MI/RI后心室重构中均发挥至关重要的作用。
PDGFR是受体酪氨酸激酶，PDGF与其受体结合后，引起受体分子的二聚化，自体激活后可使尾部的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，从而激活细胞内信号转导通路实现信号从胞外到胞内的传递[11]。有研究[12]报道，肝脏星形细胞中过表达PDGFR，可上调SHP2通路而促进肝脏纤维化。在持续性房颤患者中，心肌成纤维细胞释放的PDGF-AB可通过降低钙离子瞬时电位，促进心房结构和电活动的重构[13]。本研究发现，PDGF/PDGFR通路的抑制可改善小鼠MI/RI后心功能，减轻心肌纤维化水平。此外，PDGFR磷酸化抑制剂还可明显降低小鼠MI/RI后梗死心肌中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平[14]。另外，PDGF可引发哮喘和气道重构，而异佛斯可林可通过抑制PDGF引发的炎症因子TGF-β1和IL-1β表达，改善哮喘的发生发展[15]。而在心肌组织中，本研究表明，抑制PDGFR磷酸化可下调梗死心肌中炎症因子的表达，与该研究结果一致。因此，可以初步得出结论，PDGF/PDGFR通路的抑制可通过减轻梗死心肌中炎症反应改善MI/RI后心室重构。
在细胞水平进一步研究PDGFR磷酸化抑制剂对心肌成纤维细胞胶原合成及相关信号通路的影响。结果表明，CP-673, 451可降低NCF中ColⅠ及Col Ⅲ的mRNA水平。研究[16]表明，信号通路p38/MAPK在血管紧张素Ⅱ导致的心肌肥大和纤维化中发挥重要作用，并且是经典的酪氨酸激酶相关通路。有研究[17]表明，PDGF-BB可通过p38/MAPK通路促进肺血管重构。PDGF-DD可激活p38通路，从而促进舌鳞癌细胞的侵袭[18]。因此，本研究认为在心肌成纤维细胞中PDGF也可能与p38/MAPK通路有关。进一步Western blot结果表明，CP-673, 451可明显降低NCF中PDGF-BB刺激的p38磷酸化水平，说明PDGFR磷酸化的抑制可能通过心肌成纤维细胞中的p38/MAPK信号通路改善MI/RI后心室重构。
综上所述，MI/RI后PDGF/PDGFR通路可能介导中性粒细胞等炎症细胞的招募与浸润，并通过激活p38/MAPK通路促进MI/RI后心室重构的病理过程。PDGFR磷酸化抑制剂可通过干预PDGF/PDGFR通路这一靶点，在改善MI/RI后心室重构中发挥重要作用。这一结果可为临床治疗MI/RI介导的心室重构以及缺血性心肌病提供重要的参考依据及干预手段。
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