2020, Vol. 27
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是成人中最常见的肾癌类型，占90%~95%。常规的治疗方式通常是部分或完全切除受影响的肾脏，当肿瘤尚未转移扩散到其他器官或未深入肾脏组织，其5年生存率达65%~90%，但是当肿瘤扩散转移后，其5年生存率会大大降低，预后较差。RCC的发生发展机制仍不明确，导致其诊断和治疗十分棘手[1]。因此研究肾癌的发生发展机制，对开发新的有效诊断标志物及潜在治疗靶点有重要科学意义及临床价值。
CD40分子属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，广泛存在于B细胞(发育和分化的各个阶段)、活化的单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞、血小板、上皮细胞表面和一些肿瘤细胞表面。近期研究[2]表明，CD40在肿瘤细胞中分布广泛，现已发现其在多种肿瘤如肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌及黑色素瘤中高水平表达，并与肿瘤的产生、发展和转移以及预后存在密切关系，是肿瘤治疗的潜在靶点。
Micro-RNA是一类短序列(20~24 nt)、非编码、具调控功能的单链小分子RNA。成熟的micro-RNA可与其靶mRNA分子的3′端非编码区结合，指导靶基因降解或阻遏靶基因转录后翻译。研究[3]表明，多种micro-RNA在各种肿瘤组织的表达水平有不同的上调或下调。Micro-RNA既可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性，也可作为原癌基因，下调抑癌基因的活性。这都进一步表明，在肿瘤的发生发展过程中，micro-RNA起到重要作用。
基于以上研究，本研究探讨micro-RNA对RCC中CD40信号的调控作用，寻找与调控CD40信号相关的micro-RNA，为未来RCC的诊治提供新的、有效的潜在靶点。
1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂共收集11例RCC患者肿瘤及癌旁对照组织。本研究通过长海医院伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。
micro-RNA染料法荧光定量PCR试剂盒(B532461)，转染试剂盒(E607403)，MTT细胞增殖检测试剂盒(E606334)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，CD40单抗(Abcam，英国)，细胞培养箱(培养条件为37℃，5%CO2)，实时荧光定量PCR仪。本研究中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经HPLC纯化。Micro-RNA inhibitor和mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成。
1.2 RCC细胞提取与培养提取11例样本肿瘤细胞。手术后，将标本放入冰浴的DMEM LG(含1%青霉素/链霉素，1%两性霉素B，1%谷氨酰胺和10%胎牛血清)，置于4℃保存，并于24 h内处理。用预冷的PBS(pH 7.2)洗涤组织2次，并在培养皿中研磨。随后将其置于含DMEM-F12和1.25 mg/mL Ⅳ型胶原酶的培养基中37℃孵育2 h，每15min剧烈涡旋。然后将样品用4℃的PBS洗涤3次，铺在培养皿中，并在37℃的5%CO2中孵育。24 h后，用PBS洗涤以除去红细胞、粒细胞以及凋亡和坏死细胞，然后更换培养基。当细胞密度达到90%，用胰蛋白酶消化细胞并以1:3传代。
1.3 基因芯片micro-RNA表达谱分析利用micro-RNA及mRNA表达谱芯片筛选并鉴定RCC细胞与癌旁对照细胞中差异性表达的mRNA及micro-RNA，根据检测结果及生物信息学分析可能调控CD40的micro-RNA(由上海欧易公司合成)。进一步利用RT-PCR技术确认在肿瘤组和对照组间有表达差异的micro-RNA，目的基因相对表达量使用2-ΔΔCT方法计算。
1.4 转染miR-145 inhibitor及mimics后细胞功能检测利用转染试剂盒，分别向RCC细胞(2×105/孔)中转染miR-145 inhibitor及mimics，TGF-β刺激上述2组细胞后，利用RT-PCR检测CD40及CD40L的表达情况。同时利用RT-PCR方法检测TNF-α、IFN-γ及IL-10的表达情况，评估细胞因子分泌功能。另外利用MTT试剂盒，检测细胞增殖能力的变化情况。
1.5 加入CD40单抗后转染miR-145 mimics细胞功能检测首先在RCC细胞(2×105/孔)中加入CD40单抗(10 μg/mL)在细胞培养箱中孵育1 h，以表达拮抗CD40，然后利用转染试剂盒转染miR-145 mimics，经TGF-β刺激上述各组细胞后，利用RT-PCR方法检测TNF-α及IFN-γ的表达量，评估细胞因子释放水平的变化。
1.6 统计学处理采用GraphPad Prism 5.0软件，组间差异比较使用Mann-Whitney U检验，检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 RCC细胞与癌旁对照细胞中表达的micro-RNA和mRNA鉴定利用基因芯片分析RCC细胞与癌旁对照细胞中差异性表达的micro-RNA和mRNA后，在RCC细胞组中，micro-RNA高表达135个，micro-RNA低表达76个。进一步利用生物信息学分析工具，发现5个差异性表达的micro-RNA可能对CD40分子具有调控作用，分别为miR-381、miR-34c-5p、miR-449b、miR-145和miR-300。利用RT-PCR方法进一步验证上述5种micro-RNA在2种细胞间的表达情况，结果(图 1)表明:miR-145在RCC细胞中表达显著降低且差异有统计学意义(P＜0.01)。
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| 图 1 5种micro-RNA在RCC细胞和癌旁对照组细胞的表达情况 n=11; **P < 0.01与癌旁对照组细胞相比 |
利用转染试剂盒，体外转染miR-145 inhibitor及mimics，构建功能性miR-145低表达和高表达RCC细胞，经TGF-β刺激上述各组细胞后，结果(图 2)显示：miR-145低表达组中CD40表达显著增高(P＜0.01)，miR-145高表达组中CD40表达显著降低(P＜0.01)，而CD40L在3组间的表达差异无统计学意义。
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| 图 2 miR-145对CD40及CD40L表达变化的影响 n=11; **P < 0.01与对照组相比 |
通过构建功能性miR-145低表达和高表达RCC细胞，经TGF-β刺激上述各组细胞后，RT-PCR检测细胞因子分泌情况，结果(图 3)显示，miR-145被抑制后，TNF-α及IFN-γ的表达显著增高(P < 0.01)，miR-145过表达后，TNF-α及IFN-γ的表达显著下降(P < 0.01)，而IL-10的表达在3组间差异无统计学意义。
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| 图 3 miR-145对细胞因子表达变化的影响 n=11; **P < 0.01与对照组相比 |
利用MTT试剂盒，分析上述3组细胞的增殖情况，结果(图 4)显示，miR-145被抑制后RCC细胞增殖能力加强，而miR-145高表达后，RCC细胞增殖能力减弱。
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| 图 4 miR-145对RCC细胞增殖速度的影响 |
拮抗CD40表达后，转染miR-145 mimics，再检测RCC细胞分泌细胞因子功能，结果(图 5)发现，拮抗CD40表达后，TNF-α及IFN-γ的表达量虽然也有下调趋势，但差异无统计学意义。
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| 图 5 拮抗CD40后RCC细胞因子分泌功能 |
在肿瘤的侵袭和进展中，miR-145是一个关键因素[4]。在乳头状甲状腺癌中，miR-145的表达显著下降，并通过调控NF-κB通路参与疾病进程[5]。在试管鳞状细胞癌中，miR-145的表达同样显著下降，并通过抑制PI3K/AKT信号通路影响其对顺铂治疗的敏感性[6]。在非小细胞肺癌中miR-145同样显著低表达，其通过靶向MUC1使肿瘤更具有侵袭性。其启动子DNA异常高度甲基化是重要的表观遗传学信号，调控包括miR-145在内的多种micro-RNA的表达，进一步调控肿瘤的迁移和浸润[7]。MiR-145还可以通过靶向PAK1抑制膀胱癌细胞的侵袭，PAK1可通过磷酸化Snail促进肿瘤上皮细胞间质转型。MiR-145和PAK1均可调节MMP-9的活性，这也是膀胱肿瘤侵袭的关键步骤之一[8]。然而，miR-145在RCC患者中的表达及作用仍不明确。本研究结果证实，miR-145在RCC细胞中表达同样显著下降，对患者病情及肿瘤的增殖有一定的影响作用。
CD40分子与许多肿瘤的基本进程有密切联系，是肿瘤分子治疗的潜在有效靶点。既往研究[9]发现，CD40可能通过促进DC细胞的活化与成熟，使Th1/Th2向Th1方向极化，进而抑制肿瘤增殖。类似研究[10]表明，CD40可在体外促进小鼠DC细胞功能，上调其IL-12的表达，并激活NK细胞的功能，进一步杀伤肿瘤细胞并限制肿瘤增殖。CD40分子在胰腺癌组织中显著高表达，并且与肿瘤的TNM分期相关[11]。在多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤患者中同样发现CD40显著高表达，并且常提示患者预后较差[12]。本研究表明，CD40的表达状态与肿瘤分泌细胞因子功能有关，提示CD40可能在RCC患者中发挥了重要作用。未来还可进一步利用CD40分子评估RCC患者病情的临床价值。
综上所述，本研究通过基因芯片和RT-PCR同时发现RCC细胞中miR-145显著低表达，且miR-145可能调控CD40的表达。进一步通过CD40影响细胞因子分泌及细胞增殖。转染miR-145 mimics可减缓RCC的增殖，并减少细胞因子的分泌。上述结果显示，miR-145可调控RCC细胞的功能，在RCC疾病的发生发展中具有重要作用，是未来开发靶向RCC高效治疗药物的潜在靶点。未来的研究仍需进一步深入探讨miR-145调控肿瘤基本进程的具体机制，为相关治疗药物和监测靶点的开发提供更充分的理论及实验基础。
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