2020, Vol. 27
2. 上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室, 上海 200011;
3. 复旦大学生物医学研究院, 上海 200032
2. Laboratory of Female Reproductive Endocrine-Related Diseases, Shanghai 200011, China;
3. Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China
不孕症影响着世界范围内8%~12%的育龄人口[1]。40多年来，辅助生殖技术已经取得了巨大进展，但是临床上仍然有部分不孕症病例既没有找到病因也没有找到医治方法。目前，越来越多与不孕相关的基因和易感致病位点被筛选出来，如与透明带形成相关的ZP1、ZP2、ZP3[2]、与卵子死亡相关的PANX1[3]、与卵母细胞成熟相关的PATL2[4]和TUBB8[5]、与受精相关的WEE2[6]、与胚胎发育相关的TLE6[7]和PADI6[8]等。本研究将利用Sanger测序技术对收集的不孕症患者进行TUBB8的筛查，明确患者的致病突变，分析新的突变位点和突变表型。
1 资料与方法 1.1 研究对象纳入2018年1月至2019年6月于上海集爱遗传与不育诊疗中心接受辅助生殖技术治疗的不孕症患者23例。纳入标准：正常性生活1年以上未避孕未孕的已婚夫妇。排除标准：已知染色体异常、放化疗、其他可能导致女性不孕的生殖系统疾病、男方因素等其他明确原因导致的不孕。本研究通过上海集爱遗传与不育诊疗中心伦理委员会批准(伦研批第148号)，参与研究的患者以及能提供血液样本的患者亲属均知情并签署知情同意书。
1.2 提取基因组DNA收集患者及患者亲属的空腹静脉血5 mL，采用血液DNA提取试剂盒(Magen，美国)对研究对象的外周血样本进行基因组DNA提取。
1.3 Sanger测序针对人TUBB8(NM_177987.3)的外显子区域分段设计引物，引物序列如表 1所列。以研究对象的外周血基因组DNA为模板，用Taq PCR预混液(上海莱枫生物科技有限公司，中国)配制PCR反应体系。反应程序分为2阶段，第一阶段设置：98℃预变性3 min，98℃变性10 s，68℃退火15 s(设置12个循环，每个循环退火温度下降0.5℃)，72℃延伸30 s；第二阶段设置：98℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，设置30个循环，最后72℃延伸2 min。扩增完成后，将PCR产物送上海铂尚测序公司进行Sanger测序。
| 引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
| TUBB8-F1 | CCTGAGCTTTCCAACAGATGTTCA |
| TUBB8-R1 | CCCAGAGGATGACCTTAGCA |
| TUBB8-F2 | AGGTGAGGAGTTACTGATGTAAAC |
| TUBB8-R2 | GGAGAACACTGTCCGTGCAT |
使用SIFT(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和PROVEAN(http://provean.jcvi.org/)工具对突变位点进行有害性评估。利用人类外显子组数据库ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和基因组突变频率数据库gnomAD(http://gnomad.broadinstitute.org/)查找突变位点的频率。
2 结果 2.1 基因测序结果通过Sanger测序发现2例携带TUBB8基因突变的患者。如图 1所示，1号家系患者TUBB8上存在杂合错义突变c.550A>G(p.N184D)，其父亲为携带者，而母亲正常，说明该突变遗传自父亲(图 1)。2号家系的患者存在另一个杂合错义突变c.267C>A(p.N89K)，经检测，父母TUBB8基因均正常，说明该突变是新发的(图 1)。TUBB8基因突变位点信息见表 2。PROVEN和SIFT算法预测提示，突变c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)均为有害突变(表 2)。
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| 图 1 携带TUBB8基因突变的2个家系及测序验证 |
| 家系 | 染色体 基因组位置 |
cDNA突变 | 蛋白突变 | 突变类型 | 遗传模式 | PROVEN 预测 |
SIFT预测 | ExAC频率 | gnomAD频率 |
| 1 | chr10:93782 | c.550A>G | p.(N184D) | 错义突变 | 常染色体显性遗传 | 有害 | 不详 | 不详 | 不详 |
| 2 | chr10:94565 | c.267C>A | p.(N89K) | 错义突变 | 新发突变 | 有害 | 有害 | 不详 | 不详 |
携带TUBB8基因突变的2例患者均有多年原发不孕病史，接受过1次辅助生殖技术治疗，未获得有效胚胎。2例患者的卵子和胚胎情况见表 3。1号家系的患者为32岁，在IVF/ICSI尝试中获得了11枚卵，10枚为成熟卵子并且成功受精，胚胎能发生分裂，但是未达到可移植阶段。2号家系的患者年龄为38岁，总获卵31枚(包括3枚GV卵和28枚MⅠ卵)，卵子无法受精。
| 家系 | 年龄 (岁) |
不孕病史 (年) |
IVF/ICSI 次数 |
获卵数 | GV卵 | MⅠ卵 | 未知阶段的 不成熟卵 |
PB1卵 | 受精 胚胎数 |
可分裂 胚胎数 |
可移植 胚胎数 |
| 1 | 32 | 4 | 1 | 11 | 0 | 0 | 1 | 10 | 10 | 10 | 0 |
| 2 | 38 | 6 | 1 | 31 | 3 | 28 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| IVF:试管受精; ICSI:卵母细胞质内单精子显微注射; GV:卵核泡; MⅠ:第1次(细胞分裂)中期; PB1：第一极体 | |||||||||||
本研究通过对不孕症患者TUBB8的筛查，发现了2个新的杂合错义突变：c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)，表型分别为胚胎发育阻滞和受精障碍。
2016年首次发现人类TUBB8基因突变会导致卵子减数分裂阻滞，突变造成蛋白质折叠异常，干扰细胞微管网络的形成，破坏卵子纺锤体的组装，进而引起卵子成熟障碍[5]。随后多个研究[9-12]相继发现，TUBB8的多个致病突变位点，突变类型包括：错义突变、无义突变、移码突变等。既往研究[10]显示，该基因在不孕人群中的筛查阳性率高达30%。本研究发现的2个突变一个来源于可正常生育的父亲，另一个为新发突变，这与之前的研究结果[11]一致。值得注意的是，有些病例中的突变可来源于母亲[12]。
目前，TUBB8基因突变的表型包括：卵子成熟障碍、受精障碍、胚胎发育阻滞、胚胎种植失败等[12]。携带c.550A>G(p.N184D)突变的患者卵子可受精、继续分裂，但胚胎发育阻滞，而c.267C>A(p.N89K)突变的患者卵子不成熟、无法受精。结果提示突变位点不同会导致表型有差异。
经PROVEN和SIFT算法预测，c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)为有害突变。由于预测软件的准确率为70%~80%[13]，突变位点的致病性尚需进一步功能学实验验证。此外，Sanger测序是DNA测序技术的金标准，本研究针对TUBB8基因外显子区域进行扩增、测序，可以筛查外显子区域的多种突变类型，但不能排除位于内含子或其他区域的突变。
综上所述，本研究通过在不孕症患者中筛查TUBB8，扩展了TUBB8的突变谱和表型谱，进一步证实TUBB8在卵母细胞成熟、胚胎发育中具有重要作用。
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