2. 西安市第四医院儿童保健科, 西安 710000
2. Department of Child Healthcare, Xi'an Fourth Hospital, Xi'an 710000, Shanxi, China
哮喘是儿童常见的疾病,全球目前约有2.35亿哮喘患者,350万儿童至少有1次哮喘发作[1-2]。为了有效地治疗哮喘,探究其病因及发病的分子机制十分重要。环境因素在哮喘发作风险中起重要作用,如空气污染[3]。空气污染可导致肺功能降低、咳嗽、鼻部疾病、哮喘发作、鼻黏膜炎症和皮疹等,所有这些都可能与哮喘有关。虽然与交通相关的空气污染可加重呼吸系统疾病,并诱导现有哮喘发作。但是,儿童在室内的时间更多,因此研究室内空气污染对其哮喘发作的影响至关重要[4]。
暴露在空气中的污染物,如CO、NO2、SO2、PM10和PM2.5在哮喘发作中起重要作用[5]。miR-155是研究最多的miRNA之一,与复杂的细胞活动有关。变态反应常由高活性的CD4+辅助性T细胞2(Th2)引起,而miR-155在调节过敏性哮喘的细胞免疫活性中起重要作用[6]。本研究旨在探讨血清miR-155的变化与空气污染性哮喘的关系。
1 资料与方法 1.1 一般资料对2017年9月至2019年3月在西安市多家医院就诊的176例哮喘患儿(哮喘组)及进行体检的176名健康儿童(对照组)进行国际儿童哮喘和过敏研究(the international study of asthma and allergies in childhood,ISAAC)问卷调查。所有受试对象有身份证或户口本,如汉族、回族等民族信息均可以通过相关证件进行区分。本次研究所有程序均经医院伦理委员会批准。问卷由儿童的父母或监护人填写,问卷回收率为100%,所有数据均由本院2名专业医师进行核实。调查问题包括:过敏史、呼吸道症状、家族遗传信息、生活环境、生活习惯等。哮喘的严重程度通过肺功能测试(pulmonary function tests,PFTS)来评估[7]。所有儿童的父母或监护人签署知情同意书。
1.2 纳入与排除标准哮喘纳入标准:(1)哮喘和室内空气污染史同时存在;(2)存在气流阻塞(连续3 d或3 d以上咳嗽、喘息和呼吸困难,发生2次或2次以上;(3)β受体激动剂吸入后,第1秒用力呼气容积(FEV1)增加15%;(4)本实验之前,持续性哮喘至少发生3个月。排除标准:(1)哮喘发生3个月内使用维生素和(或)抗生素进行治疗;(2)有严重的器官衰竭,严重的心脏、肾脏等疾病。
1.3 miR-155检测每名受试者抽取5 mL静脉血,置于含有2%乙二胺四乙酸抗凝剂的一次性试管中,并充分混合,在4℃下以1 500 r/min离心15 min,收集血清,存储于-80℃。采用RT-PCR法定量检测血清miR-155。用microRNA分析试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。用5 μL RNA提取液、0.2 μL 100 mmol/L dNTPs、1.5 μL逆转录酶(50 U/μL)、2 μL 10×缓冲液、0.2 μL RNA酶抑制剂(20 U/μL)、0.5 μL引物(20 μm,正向引物:5′-GCG GTT AAT GTA ATC GTG AT-3′,反向引物:5′-GTG CGG GCG AGG T-3′)和9.6 μL双蒸水在20 μL反应体系下进行反应。将预混物在16 ℃下反应30 min,42 ℃反应30 min,90 ℃反应5 min。另外,用12 μL预混物、1.2 μL引物和6.8 μL无RNA的双蒸水扩增5 μL cDNA溶液(最终共25 μL)。在7500实时PCR系统(美国赛默费希尔科学公司)上进行qPCR,在94 ℃下反应5 min,进行45个循环(共10 s),在66 ℃下反应45 s。根据ΔΔCT法计算U6核小RNA(正向引物:5′-CTC GCT CGC AGC CA-3′;反向引物,5′-AAC GCT TCA ATT TGC GT-3′)与miR-155的相对水平。
1.4 室内空气采集及质量分析根据中国《室内空气质量标准》(GB/T1883-2002)进行采样,采样点应高出地面1.0~1.5 m,所有门窗在采样前关闭12 h[8]。根据ISO 10012-1和ISO 14644以及美国联邦标准209[9],用手持粒子计数器(美国Lighthouse 3016IAQ)测量室内粒子(PM10、PM2.5和PM1)浓度。
从起居室和卧室采集多个颗粒样品,采样率设定为2.83 L/min,家庭成员正常生活期间,从周一至周五19:00至20:00每天采样1 h。采用大气采样器(北京国际环境卫生研究所环境保护研究所)采集甲醛(HCHO)和NO2样品,采用N-(1-萘基)-乙二胺二氢氯化物分光光度法测定。同时对客厅和卧室的空气污染物进行测量,测量时间为2个月。
1.5 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以[n(%)]表示,组间比较采用t检验。符合正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采用卡方检验;不符合正态分布的数据以M(P25,P75)表示,组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验。对哮喘的诱发因素进行单因素和多因素回归分析。血清miR-155水平与室内空气污染水平的关系采用Spearman秩相关系数分析。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 两组儿童基本资料的比较结果(表 1)表明:两组儿童性别构成、年龄、体质指数、民族分布差异无统计学意义。
N=176 | |||||||||||||||||||||||||||||
指标 | 哮喘组 | 对照组 | 统计值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
男/女 | 98/78 | 100/76 | 0.046 | 0.830 | |||||||||||||||||||||||||
年龄/岁 | 10.48±3.12 | 10.21±2.73 | 0.864 | 0.119 | |||||||||||||||||||||||||
体质指数/(kg·m-2) | 24.37±4.79 | 24.84±4.84 | -0.916 | 0.384 | |||||||||||||||||||||||||
哮喘严重程度评分/分 | 4.33±1.28 | - | - | - | |||||||||||||||||||||||||
民族n(%) | 1.378 | 0.502 | |||||||||||||||||||||||||||
汉族 | 146(82.95) | 141(80.11) | |||||||||||||||||||||||||||
回族 | 24(13.63) | 31(17.61) | |||||||||||||||||||||||||||
其他 | 6(3.41) | 4(2.27) |
从500 μL血清中分离得到总RNA的0.05~0.29 μg/μL。结果(图 1)显示:哮喘组的血清miR-155水平为((7.61±2.47)μg/μL,大于对照组[3.31±1.24)μg/μL],差异有统计学意义(P < 0.001)。
2.3 两组室内空气污染物比较结果(表 2)表明:哮喘组室内PM10、PM2.5、PM1、HCHO、NO2浓度均高于对照组(P < 0.05)。
N=176;M(P25, P75) | |||||||||||||||||||||||||||||
指标 | 哮喘组 | 对照组 | Z值 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
PM10 | 204.64(138.86, 310.53) | 157.38(110.56, 249.53) | -2.464 | 0.004 | |||||||||||||||||||||||||
PM25 | 43.15(28.75, 54.86) | 26.43(18.53, 36.85) | -4.490 | 0.001 | |||||||||||||||||||||||||
PM1 | 15.38(9.56, 28.31) | 12.25(7.65, 17.43) | -3.085 | 0.001 | |||||||||||||||||||||||||
HCHO | 36.59(22.31, 58.43) | 25.32(15.46, 45.63) | -1.663 | 0.017 | |||||||||||||||||||||||||
NO2 | 30.21(20.45, 44.97) | 22.04(16.43, 32.45) | -2.894 | 0.003 | |||||||||||||||||||||||||
HCHO:甲醛 |
单因素分析(表 3)显示:两组儿童过敏史、母乳喂养、环境烟草烟雾(environmental tobacco smoke, ETS)暴露、室内植物比例差异有统计学意义(P < 0.05),鼻炎史无差异。
N=176,n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
项目 | 哮喘组 | 对照组 | χ2 | P值 | |||||||||||||||||||||||||
过敏史 | 91(55.11) | 31(17.61) | 45.160 | <0.001 | |||||||||||||||||||||||||
鼻炎史 | 44(25.00) | 33(18.75) | 2.011 | 0.156 | |||||||||||||||||||||||||
母乳喂养 | 91(51.70) | 130(73.86) | 18.493 | <0.001 | |||||||||||||||||||||||||
ETS暴露 | 125(71.02) | 74(42.05) | 30.070 | <0.001 | |||||||||||||||||||||||||
室内植物 | 76(43.18) | 158(89.77) | 85.718 | <0.001 | |||||||||||||||||||||||||
ETS:环境烟草烟雾 |
将上述有差异的危险因素纳入logistic多因素回归分析,结果(表 4)显示:儿童过敏史、母乳喂养、ETS、PM2.5、HCHO与哮喘发作相关(P < 0.05),其中母乳喂养对儿童哮喘有保护作用。
N=176 | |||||||||||||||||||||||||||||
变量 | B | S.E. | Wald | P值 | OR | 95%CI | |||||||||||||||||||||||
过敏史 | 1.859 | 0.483 | 14.583 | 0.001 | 5.583 | 2.578~17.745 | |||||||||||||||||||||||
母乳喂养 | -0.854 | 0.418 | 4.253 | 0.039 | 0.431 | 0.194~0.925 | |||||||||||||||||||||||
ETS | 1.162 | 0.431 | 7.259 | 0.007 | 3.569 | 1.182~7.338 | |||||||||||||||||||||||
PM2.5 | 0.814 | 0.256 | 7.673 | 0.002 | 2.351 | 1.053~4.629 | |||||||||||||||||||||||
HCHO | 0.556 | 0.193 | 8.325 | 0.001 | 2.845 | 1.079~5.253 | |||||||||||||||||||||||
ETS:环境烟草烟雾;HCHO:甲醛 |
结果(表 5)显示:哮喘组血清miR-155水平与儿童过敏史、母乳喂养、ETS、PM2.5、HCHO均相关(P < 0.05);对照组无此相关性。
N=176 | |||||||||||||||||||||||||||||
影响因素 | miR-155(50%截断点) ρB/(ng·μL-1) |
哮喘组 | 对照组 | ||||||||||||||||||||||||||
OR(95%CI) | P值 | OR(95%CI) | P值 | ||||||||||||||||||||||||||
过敏史 | 1.25±0.16 | 2.35(0.28~4.58) | 0.031 | 1.21(0.41~1.89) | 0.172 | ||||||||||||||||||||||||
母乳喂养 | 0.75±0.03 | 0.25(0.04~0.69) | 0.001 | 0.98(0.18~1.83) | 0.093 | ||||||||||||||||||||||||
ETS | 0.97±0.08 | 1.59(0.56~2.74) | 0.028 | 1.31(0.85~1.92) | 0.064 | ||||||||||||||||||||||||
PM2.5 | 1.09±0.19 | 1.35(0.63~2.92) | 0.018 | 1.22(0.61~2.38) | 0.125 | ||||||||||||||||||||||||
HCHO | 1.84±0.31 | 2.51(0.39~5.02) | 0.021 | 1.36(0.51~2.90) | 0082 | ||||||||||||||||||||||||
ETS:环境烟草烟雾;HCHO:甲醛 |
空气污染物加重了儿童哮喘症状的严重程度。空气污染中的颗粒物与儿童呼出的高浓度NO2有关;柴油废气颗粒和汽车排放的NO2会降低儿童血液的酸碱度,而较低的酸碱度可引起气道炎症[10]。研究[11]报道,肺泡液中较低的酸碱度和较高水平的表皮生长因子可导致哮喘患者发生全身炎症。多环芳烃是大气污染的主要成分,超过30%的多环芳烃可被人体吸入[12]。多环芳烃能破坏抗氧化防御系统,间接导致儿童哮喘的发作。此外,控制空气污染引起的氧化应激和防止呼吸器官损伤可减少儿童哮喘的发作。
本研究显示,西安市哮喘儿童家庭室内PM10、PM2.5、PM1、HCHO和NO2均较高,可能与汽车尾气排放和工业发展有关。在中国,烹饪和吸烟是与室内PM2.5的主要来源。其中,使用煤炭的家庭室内颗粒物比较高,而使用燃气或电做饭可使PM2.5降低40%~70%[13]。PM2.5常在公共室内场所(如吸烟休息室)被检测到,主要含有苯并芘、多环芳烃和邻苯二甲酸酯等[14]。一般认为,室内吸烟、烹饪、ETS和家庭装饰增加了室内颗粒物的浓度,使儿童哮喘的发生风险增加。
本研究logistic多因素回归分析显示,室内PM2.5暴露是儿童哮喘发生的独立危险因素(P < 0.05)。HCHO是主要的室内空气污染物之一,具有强烈的刺激性气味。本研究表明,HCHO也是儿童哮喘发生的独立危险因素(P < 0.05)。母乳含有大量的IgA、细胞因子、长链脂肪酸和低聚糖等物质,可以改善婴儿的免疫状态[15]。本研究发现,母乳喂养是避免儿童哮喘发作的一个保护因素(P < 0.05)。
miR-155在哺乳动物呼吸系统中表达较广泛,是通过降低Th2来调节炎症活性的潜在治疗靶点,且在哮喘进展中起重要作用[6]。microRNA检测是诊断小儿哮喘的一种简单、无创的方法。本研究发现,miR-155可能与儿童哮喘的风险增加有关。本研究为儿童哮喘的基因治疗和环境因素控制提供了理论依据,但还需要进一步的工作来证实。
本研究存在的局限性:未能分析miR-155与儿童哮喘关系的相关分子机制;同时未能分析空气污染通过影响血清miR-155水平诱发哮喘的分子机制;未分析室内污染物产生的原因。与吸烟相比,烹饪可能是增加室内颗粒物的主要因素。今后还需要进一步的研究来深入探讨上述问题。
综上所述,室内空气污染与西安市儿童哮喘的发生有关,并使其血清miR-155水平升高;哮喘患儿血清miR-155水平与室内PM2.5和HCHO水平密切相关。因此,血清miR-155水平可能成为判断哮喘的潜在指标。
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