2019, Vol. 26
高尿酸血症与慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)之间关系密切，互相影响。一方面随着CKD进展，肾功能不断丢失，尿酸从肾脏排泌出现障碍，导致体内尿酸水平进一步增高；另一方面，高尿酸血症能造成肾脏损害，并且是CKD进展的重要因素[1]。一般认为，尿酸造成的肾脏损伤主要位于小管及间质部位，其主要机制为尿酸盐结晶沉积在肾组织导致局部发生炎症反应，出现肾小管萎缩及间质纤维化[2]。然而，近年来也有研究[3-4]发现，尿酸亦可损伤肾小球系膜细胞。这就提示尿酸导致的肾损害并非局限于肾小管-间质部位。足细胞作为肾小球的固有细胞，在肾脏病进展中发挥重要作用。尿酸对足细胞是否有损害作用及其机制如何目前尚不清楚，本研究拟就此进行探讨。
1 材料与方法 1.1 动物及模型的建立雄性SD大鼠40只，体质量163~212 g，6~7周龄，随机分为4组，每组10只，即对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组。所有大鼠正常喂养。其中，轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组均以尿酸酶抑制剂—氧嗪酸钾灌胃，剂量分别为每日400、800、400 mg/kg；别嘌醇干预组再以别嘌醇灌胃，剂量为25 mg/kg。喂养期间每周称大鼠体质量，以调整给药剂量。对照组每日予以等容量蒸馏水灌胃。
1.2 检测方法所有大鼠饲养24周后处死。心脏内取血，离心后取血清待检。分离出左肾并切除，0.9%氯化钠液冲洗后，分别行苏木精-伊红(H-E)染色、免疫组化检测、Western印迹、RT-PCR、电镜检查。血清指标尿酸(UA)、肌酐(Scr)用生化分析仪检测。H-E染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，染色后在光镜下观察肾小球及肾小管、肾间质病变。
1.2.1 免疫组化法检测AngⅡ、IL-6、SOD在肾组织中的表达多聚赖氨酸溶液、免疫组化笔、PBS、Triton-X100、AngⅡ抗体、IL-6抗体、SOD抗体、柠檬酸钠缓冲液、50×TAE电泳缓冲液购自江苏凯基生物技术股份有限公司。DAB Kit、EliVision plus试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。苏木精染色液购自南京建成生物工程研究所。中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司。
肾组织经二甲苯冲洗2次，每次5 min，先后予以100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各冲洗3 min，PBS冲洗3次(每次3 min)。将抗原修复缓冲液加热至沸腾，将组织切片放到已沸腾的缓冲液中20 min，自然冷却后，PBS冲洗3次(每次5 min)；3%H2O2，15~25 ℃孵育10 min，PBS冲洗3次(每次5 min)。滴加即用型山羊血清50~100 μL, 室温孵育20 min。滴加一抗(1:200稀释) 50~100 μL，37℃湿盒孵育2 h，PBS浸洗3次，滴加增强剂50 μL，室温湿盒孵育30 min。PBS浸洗3次；滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体50 μL，37℃孵育30 min。PBS浸洗3次；用新鲜配制的DAB显色液室温下显色5~10 min，蒸馏水冲洗10 min终止显色。苏木精复染，蒸馏水冲洗5 min。0.1% HCl分化，自来水冲洗，蓝化。切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。各指标的表达情况用平均光密度值表示。平均光密度值=积分光密度(IOD)/阳性面积分布(AREA)。
1.2.2 Western印迹法检测nephrin、podocin在肾组织中的表达取100 mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成约3 mm×3 mm的小块，用预冷Lysis Buffer细胞裂解液提取蛋白。根据凯基Braford蛋白含量检测试剂盒说明测定所提取蛋白的浓度，取等量组织蛋白样本于沸水中煮5 min，使蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转入NC膜，转膜完毕后，用含5%脱脂奶粉的封闭液摇床震荡2 h；用特异抗nephrin、podocin抗体孵育(用5%的封闭液1:500稀释，抗体购自武汉博士德生物工程有限公司)，以β-actin作内参(1:1 500，南京凯基公司)，洗膜后，二抗孵育(1:2 000，南京凯基公司)，室温摇床振荡反应1~2 h；ECL(南京凯基公司)化学发光法曝光，使用G:BOX chemiXR5成像。运用Gelpro软件进行灰度值分析。
1.2.3 RT-PCR法检测nephrin mRNA、podocin mRNA在肾组织中的表达细胞样本用冷PBS洗3次，六孔板中每孔加入1 mL TRIzol(美国Invitrogen公司)，对总RNA进行纯度的测定，定量后反转录成cDNA(42℃ 1 h，70℃ 10 min, 然后置于冰上5 min)，cDNA置于-20℃保存。使用时稀释10倍，按照反转录试剂盒(日本TOYOBO)说明书进行PCR扩增，反应条件：95℃变性5 min；变性95℃ 15 s、退火60℃ 20 s、延伸72℃ 40 s，扩增定量程序40个循环。熔解曲线：60~95℃，加热速率为0.1℃/s，内参基因为GAPDH。每个样品均设3个复孔，重复实验2次。引物序列：nephrin上游引物5′-GCT GGC CCA TCA CTG TCA TT-3′，下游引物5′-TCA GTG ACT TTG TTC TTG TGC T-3′；podocin上游引物5′-AAG AAG TCA AAG GCC GGG AG-3′，下游引物5′- TCC ACA TTC ACT ACC GTG GC-3′；GAPDH上游引物5′-GGC CTT CCG TGT TCC TAC C-3′，下游引物5′-CGC CTG CTT CAC CAC CTT C-3′。
1.2.4 电镜下观察足细胞的超微形态肾组织标本用PBS洗涤后置于EP管，用2.5%戊二醛(磷酸缓冲液配制)固定2 h；4℃冰箱内先后予以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮(1:1)、90%丙酮脱水15~20 min，再于室温下用100%丙酮脱水3次(每次15~20 min)；室温下纯丙酮+包埋液(2:1)放置3 h，丙酮+包埋液(1:2)过夜，纯包埋液于室温下放置3 h，37℃烘箱内过夜，45℃烘箱及60℃烘箱内分别放置12、24 h。用超薄切片机切成50~60 nm薄片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。切片在透射电镜下观察、拍片。
1.3 统计学处理采用SPSS 23.0统计软件包进行分析，所有数据以x±s表示。组间比较采用t检验，变量间相关性采用单因素相关分析。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 各组血肌酐及尿酸水平的比较结果(表 1)表明：两两相比，血肌酐水平差异均无统计学意义，血尿酸水平差异有统计学意义(P < 0.05)。
| n=10，cB/(μmol·L-1) | |||||||||||||||||||||||||||||
| 指标 | 对照组 | 轻微高尿酸组 | 高尿酸组 | 别嘌醇干预组 | |||||||||||||||||||||||||
| 血肌酐 | 38.20±5.73 | 37.50±4.86 | 35.50±4.38 | 35.90±6.47 | |||||||||||||||||||||||||
| 血尿酸 | 65.04±5.26 | 106.87±11.00* | 147.23±25.75*△ | 89.78±11.67*△▽ | |||||||||||||||||||||||||
| *P < 0.01与对照组相比；△P < 0.01与轻微高尿酸组相比；▽P < 0.01与高尿酸组相比 | |||||||||||||||||||||||||||||
结果(图 1)表明：各组大鼠肾小球均未见明显病理学异常；轻微高尿酸组、高尿酸组肾小球系膜区有核细胞数略多。
|
| 图 1 大鼠肾脏H-E染色结果 A:对照组；B:轻微高尿酸组；C:高尿酸组；D:别嘌醇干预组. Original magnification:×200 |
结果(图 2、图 3)表明：AngⅡ主要表达于肾小球系膜区，少量表达于肾小管上皮细胞；对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组AngⅡ表达水平分别为0.19±0.04、0.28±0.06、0.37±0.09、0.24±0.05。IL-6主要表达于肾小管上皮细胞，少量表达于肾小球；对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组IL-6的表达水平分别为0.22±0.02、0.25±0.02、0.29±0.04、0.23±0.01。SOD在肾小球及肾小管内均表达；对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组SOD的表达水平分别为0.30±0.05、0.22±0.05、0.18±0.03、0.26±0.02。各组两两比较AngⅡ、IL-6、SOD差异均有统计学意义(P < 0.05)。
|
| 图 2 免疫组化检测各组肾组织AngⅡ、IL-6、SOD的表达 A:AngⅡ; B:IL-6;C:SOD. Original magnification: ×200 |
|
| 图 3 各组大鼠肾组织AngⅡ、IL-6、SOD表达的比较 *P < 0.05, **P < 0.01与对照组相比；△P < 0.05与轻微高尿酸组相比；▽▽P < 0.01与高尿酸组相比 |
结果(图 4)表明：对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组大鼠肾组织nephrin相对表达水平分别为0.49±0.03、0.44±0.02、0.38±0.04、0.46±0.02，podocin相对表达水平分别为0.36±0.03、0.31±0.01、0.28±0.03、0.33±0.02，各组间两两相比差异均有统计学意义(P < 0.05)。
|
| 图 4 Western印迹检测各组肾组织nephrin、podocin的表达 1：对照组；2：轻微高尿酸组；3：高尿酸组:4：别嘌醇干预组. *P < 0.05, **P < 0.01与对照组相比；△P < 0.05与轻微高尿酸组相比；▽▽P < 0.01与高尿酸组相比 |
结果(图 5)表明：对照组、轻微高尿酸组、高尿酸组、别嘌醇干预组大鼠肾组织nephrin mRNA表达水平分别为1.02±0.05、0.60±0.04、0.48±0.03、0.71±0.05，podocin mRNA表达水平分别为0.99±0.03、0.62±0.03、0.47±0.03、0.74±0.03，各组间两两相比差异均有统计学意义(P < 0.05)。
|
| 图 5 RT-PCR法检测肾组织nephrin、podocin的表达 *P < 0.05, **P < 0.01与对照组相比；△P < 0.05与轻微高尿酸组相比；▽▽P < 0.01与高尿酸组相比 |
结果(图 6)显示：对照组肾小球基本正常，系膜区少量电子致密物沉积，足细胞未见明显病变，肾小管上皮细胞未见异常；轻微高尿酸组肾小球基本正常，足细胞形态基本正常，有足突融合现象，肾小管上皮细胞轻度萎缩；高尿酸组肾小球系膜区增生、基质略增多，足细胞胞体基本正常，足突融合较明显，高尔基体略肿胀，肾小球上皮细胞肿胀、萎缩较明显；别嘌醇干预组肾小球系膜略增生，足细胞胞体基本正常，部分足突有融合现象，肾小管上皮细胞略肿胀。
|
| 图 6 各组大鼠肾脏病理(电镜) A:对照组；B:轻微高尿酸组；C:高尿酸组；D:别嘌醇干预组. Original magnification: ×1 000 |
结果(图 7)显示：血尿酸水平与肾组织中nephrin、podocin、SOD的表达负相关，而与肾组织中AngⅡ及IL-6的表达正相关。肾组织中AngⅡ、IL-6的表达与nephrin、podocin的表达负相关；肾组织中SOD的表达与nephrin、podocin的表达正相关(P < 0.05)。
|
| 图 7 血尿酸水平与肾组织中各指标的相关性分析 |
大量研究已证实高尿酸血症对肾脏存在损害作用。美国Jackson心脏研究[5]数据显示，血尿酸增高与肾功能迅速下降及CKD发生相关。国内一项队列研究[6]显示，血尿酸水平与估算肾小球滤过率(eGFR)下降和CKD发生的可能性增加独立相关。目前认为尿酸导致肾脏损害机制较为复杂，尿酸盐沉积可能直接导致肾脏损害，也可能通过小管-间质病变[7]、血管病变等引起肾脏损害。也有研究[8]表明，尿酸升高是肾小球损伤的独立危险因素，而不是肾小管损伤的独立危险因素。因此有必要进一步研究尿酸与肾小球病变之间的关系。
足细胞是肾小球内主要的固有细胞之一，由细胞体、主突和足突组成。足细胞发生损害时，其特异性蛋白如nephrin、podocin等出现表达异常[9]，提示通过检测其表达情况可反映足细胞损伤程度。近年研究[10]表明，足细胞损伤与肾小球疾病的进展关系密切，是糖尿病肾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、局灶节段硬化性肾病综合征等多种肾脏病进展的重要机制之一。导致足细胞损伤的因素众多、机制复杂，包括中毒、感染、血流动力学改变、代谢性因素(如高糖刺激、蛋白负荷过重)等。然而，高尿酸血症是否与足细胞损伤有关，目前鲜有研究。
本研究通过氧嗪酸钾灌胃的方法成功建立高尿酸血症大鼠模型。电镜观察各组大鼠肾小球足细胞病变，可见高尿酸血症大鼠存在不同程度的足突融合，且随着尿酸水平升高，足突融合更趋严重。高尿酸血症大鼠肾小球足细胞内线粒体、高尔基体等细胞器也存在程度轻重不一的损害。本研究通过Western印迹及RT-PCR法发现，轻微高尿酸组、高尿酸组nephrin、podocin的表达均显著低于对照组，其中高尿酸组表达更低，别嘌醇干预血尿酸水平，nephrin、podocin的表达回升。相关性分析显示，血尿酸水平与肾组织中nephrin、podocin的表达负相关。上述结果显示，高尿酸血症可造成足细胞损害，且血尿酸水平与足细胞损害严重程度有关。
进一步研究显示，轻微高尿酸组、高尿酸组肾组织AngⅡ、IL-6的表达较对照组增加，其中高尿酸组增加更明显，别嘌醇干预组肾组织AngⅡ、IL-6的表达水平回落；SOD的表达水平呈相反变化，各组间比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。相关性分析显示，血尿酸水平与肾组织AngⅡ、IL-6、SOD的表达水平相关，而肾组织中AngⅡ、IL-6、SOD的表达水平与肾组织nephrin、podocin的表达亦相关。上述结果提示，尿酸可通过活化RAS系统，促进微炎症状态及氧化应激，从而导致足细胞损害，且损害严重程度与尿酸水平、RAS系统活性、微炎症状态、氧化应激水平正相关。
氧化应激反应是导致足细胞损伤的一个重要因素[11-13]。多项实验[14-15]已证实，通过降低氧化应激反应可改善肾小球足细胞损伤。氧化应激水平增强可通过扰乱内质网稳态、激活足细胞内质网应激进而导致足细胞损伤，自噬也参与其中[16]。RAS系统活化也是导致足细胞损伤的重要机制之一[17]。RAS系统活化可通过增加钙内流和活性氧的生成促进足细胞损伤，并可通过促进足细胞自噬、诱导足细胞肥大、增加细胞凋亡、改变肾小球基底膜表面电荷屏障等机制导致足细胞损伤[18-21]。肾脏局部微炎症反应水平可改善肾脏病变[22]。在某些病理状态下，足细胞表面炎症因子表达异常，可加重足细胞损害及肾脏病理损伤[23]。
综上所述，本研究采用氧嗪酸钾灌胃的方法成功建立高尿酸血症大鼠模型，研究表明高尿酸血症可导致肾小球足细胞损害，且两者间存在线性相关，用别嘌醇降低血尿酸水平后，足细胞损害减轻。其可能机制包括高尿酸血症导致的氧化应激反应、RAS活化、微炎症反应等。本研究进一步阐明了尿酸的肾毒性，并提示可通过调控体内氧化应激状态、RAS活性、微炎症反应等措施来减轻尿酸所导致的足细胞损害、延缓CKD进展。然而，导致足细胞损伤的原因、机制众多，且不同原因、机制之间互相影响、互相作用，因此相关机制有待通过体外实验等进一步证实。
| [1] |
徐夏莲, 许佳瑞, 王一梅, 等. 术前血尿酸水平对心脏手术术后急性肾损伤发生的影响[J]. 中国临床医学, 2019, 26(3): 450-455. [URI]
|
| [2] |
王洪云, 许冬梅. 慢性高尿酸血症肾损害发病机制的研究进展[J]. 国际泌尿系统杂志, 2011, 31(1): 109-112. [DOI]
|
| [3] |
彭俊琼, 袁伟杰, 张威, 等. 尿酸通过激活p38信号通路上调大鼠肾小球系膜细胞前列腺素E2的表达[J]. 中华肾脏病杂志, 2013, 29(6): 454-457. [DOI]
|
| [4] |
LI S, ZHAO F, CHENG S, et al. Uric acid-induced endoplasmic reticulum stress triggers phenotypic change in rat glomerular mesangial cells[J]. Nephrology (Carlton), 2013, 18(10): 682-689.
[URI]
|
| [5] |
MWASONGWE S E, FÜLÖP T, KATZ R, et al. Relation of uric acid level to rapid kidney function decline and development of kidney disease:The Jackson Heart Study[J]. J Clin Hypertens (Greenwich), 2018, 20(4): 775-783.
[DOI]
|
| [6] |
YE M, HU K, JIN J, et al. The association between time-mean serum uric acid levels and the incidence of chronic kidneydisease in the general population:a retrospective study[J]. BMC Nephrol, 2018, 19(1): 190.
[DOI]
|
| [7] |
MILANESI S, VERZOLA D, CAPPADONA F, et al. Uric acid and angiotensin Ⅱ additively promote inflammation and oxidative stress in human proximal tubule cells by activation of toll-like receptor 4[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(7): 10868-10876.
[DOI]
|
| [8] |
KONTA T, KAMEI K, ICHIKAWA K, et al. The association between serum uric acid and renal damage:The Takahata Study-New Insights[J]. Contrib Nephrol, 2018, 192: 34-40.
[URI]
|
| [9] |
CELLESI F, LI M, RASTALDI M P. Podocyte injury and repair mechanisms[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2015, 24(3): 239-244.
[DOI]
|
| [10] |
张丽萍, 裴华颖, 王建荣, 等. 足细胞损伤对IgA肾病肾小球硬化的作用[J]. 中国临床医学, 2008, 15(3): 395-396. [DOI]
|
| [11] |
BHATTI A B, USMAN M. Drug targets for oxidative podocyte injury in diabetic nephropathy[J]. Cureus, 2015, 7(12): e393.
[URI]
|
| [12] |
MO H, WU Q, MIAO J, et al. C-X-C chemokine receptor type 4 plays a crucial role in mediating oxidative stress-induced podocyte injury[J]. Antioxid Redox Signal, 2017, 27(6): 345-362.
[DOI]
|
| [13] |
RAIJ L, TIAN R, WONG J S, et al. Podocyte injury:the role of proteinuria, urinary plasminogen, and oxidative stress[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 311(6): F1308-F1317.
[DOI]
|
| [14] |
LIU X, CAO W, QI J, et al. Leonurine ameliorates adriamycin-induced podocyte injury via suppression of oxidative stress[J]. Free Radic Res, 2018, 52(9): 952-960.
[DOI]
|
| [15] |
WANG B, XU X, HE X, et al. Berberine improved aldo-induced podocyte injury via inhibiting oxidative stress and endoplasmic reticulum stress pathways both in vivo and in vitro[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(1): 217-228.
|
| [16] |
YUAN Y, XU X, ZHAO C, et al. The roles of oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and autophagy in aldosterone/mineralocorticoid receptor-induced podocyte injury[J]. Lab Invest, 2015, 95(12): 1374-1386.
[DOI]
|
| [17] |
CHEN L, CHEN D Q, WANG M, et al. Role of RAS/Wnt/β-catenin axis activation in the pathogenesis of podocyte injury and tubulo-interstitial nephropathy[J]. Chem Biol Interact, 2017, 273: 56-72.
[DOI]
|
| [18] |
YACOUB R, CAMPBELL K N. Inhibition of RAS in diabetic nephropathy[J]. Int J Nephrol Renovasc Dis, 2015, 8: 29-40.
[URI]
|
| [19] |
MÁRQUEZ E, RIERA M, PASCUAL J, et al. Renin-angiotensin system within the diabetic podocyte[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2015, 308(1): F1-F10.
[DOI]
|
| [20] |
CAMPBELL K N, RAIJ L, MUNDEL P. Role of angiotensin Ⅱ in the development of nephropathy and podocytopathy of diabetes[J]. Curr Diabetes Rev, 2011, 7(1): 3-7.
[DOI]
|
| [21] |
MAO N, TAN R Z, WANG S Q, et al. Ginsenoside Rg1 inhibits angiotensin Ⅱ-induced podocyte autophagy via AMPK/mTOR/PI3K pathway[J]. Cell Biol Int, 2016, 40(8): 917-925.
[DOI]
|
| [22] |
XUE H Y, YUAN L, CAO Y J, et al. Resveratrol ameliorates renal injury in spontaneously hypertensive rats by inhibiting renal micro-inflammation[J]. Biosci Rep, 2016, 36(3): e00339.
[DOI]
|
| [23] |
刘琳, 陈茂盛, 金娟, 等. 雷公藤甲素对足细胞炎症反应及胞吞作用的研究[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2018, 19(2): 105-108. [DOI]
|
