2023, Vol. 30
也被称为环境分枝杆菌或除结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae，M.leprae）以外的分枝杆菌，在环境中随处可见，属于条件致病菌，大部分为寄生菌，仅少部分可致病[1]。
然而，随着结核病疫情得到控制以及检测手段的不断进步，NTM病在分枝杆菌疾病中所占比例逐步提高；在结核病疫情获得控制的发达国家，NTM病的发病率和致死率已超过MTB复合群[2-5]。我国虽未开展大样本的NTM病流行病学调查，但历次结核病监测项目报告均显示NTM分离率明显上升，由1979年的4.3%增加至2000年的11.1%，2010年升至21%[3]。一项关于2015年至2020年深圳市10区NTM病情况的研究[6]发现，NTM在分枝杆菌培养阳性患者中的分离率逐年升高，从2015年的3.53%升高至2020年的11.00%，约升高2倍。由于NTM病不是法定报告传染病，加之NTM识别技术操作繁琐，因此尽管NTM分离率持续上升，但其发病率仍可能被低估[7]。
1.2 NTM菌种分布特征尽管大多数NTM不具有致病性，临床感染率低，但在临床样本中反复分离到的致病NTM也已多达60种[8]。致病NTM中，鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex，MAC）分离率居榜首，占所有NTM分离株的34%~61%[9]，其次分别为脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）和偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum，MF）。多项研究[10-11]表明，MAC肺病发病率占美国所有NTM肺病的85%，该比例在欧洲为82%，在东亚为76.2%。其中，鸟型分枝杆菌（Mycobacterium avium）是北美（69%）、南美（70%）和欧洲（53%）最常见的MAC分离种；胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）是非洲（77%）和大洋洲（80%）最常见的MAC分离种[12]。MAC也是我国分布最广泛的致病NTM，但所占比例较小（27.46%）[8]。其中，胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌则是我国临床最常见的MAC菌种，而在我国大部分地区，胞内分枝杆菌已取代脓肿分枝杆菌成为优势种[6]。
1.3 NTM的细菌学分类现状目前共发现200余种NTM菌种，包括14个亚种。国际上一般根据NTM成熟菌落在固体培养基上的生长时间，将其分为快速生长型和缓慢生长型两大类[13-14]。
快速生长型分枝杆菌经过3~5 d的培养即出现肉眼可见的菌落，多数1周内即生长旺盛，包括脓肿分枝杆菌复合群（Mycobacterium abscessus complex，MABC）、MF、龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）、玛格丽特分枝杆菌（Mycobacterium mageritense）、外来分枝杆菌（Mycobacterium peregrinum）等[14]。
缓慢生长分枝杆菌的生长时间多≥7 d，可根据菌落形态及色素产生与光反应的关系分为光产色菌、暗产色菌、不产色菌。光产色菌：以堪萨斯分枝杆菌（Mycobacterium kansasii）、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）及猿分枝杆菌（Mycobacterium simiae）为主；暗产色菌：以瘰疬分枝杆菌（Mycobacterium scrofulaceum）、戈登分枝杆菌（Mycobacterium gordonae）及苏尔加分枝杆菌（Mycobacterium szulgai）为主；不产色菌：包括MAC、嗜血分枝杆菌（Mycobacterium haemophilum）、溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）、蟾分枝杆菌（Mycobacterium xenopi）、玛尔摩分枝杆菌（Mycobacterium malmoense）、土地分枝杆菌（Mycobacterium terrae）及胃分枝杆菌（Mycobacterium gastri）等[14]。
1.4 NTM病的临床特征NTM曾被认为仅对肺结构缺陷或免疫功能低下的人群有致病性，但目前已被证实能感染免疫能力正常的儿童和成人，且感染率不断上升[15]。而且，NTM能引起人体肺部、皮肤、软组织、淋巴结和骨骼等各部位的感染，其中以肺部感染最常见(65%~90%)[1, 16]，可导致免疫系统功能严重受损的患者发生播散性感染[7, 13]。NTM病大多发病缓慢，临床表现常呈非特异性。
1.4.1 NTM肺病NTM肺病常发生于有肺部基础疾病（如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺纤维化）的患者，表现为与结核病相似的全身中毒症状和局部损害，但低热、盗汗、乏力、消瘦等全身中毒症状常较肺结核病轻[3, 13]。
1.4.2 NTM肺外感染NTM肺外感染以皮肤、软组织感染最常见，患者除有上述全身症状外，还可出现感染部位的非特异性变化，如皮肤结节、疼痛、红斑；肌肉骨骼感染可表现为肌肉萎缩、关节疼痛、僵硬等；淋巴结感染可表现为质韧无痛的淋巴结肿大，并伴有皮肤变化；播散性NTM病可导致散在的皮肤病变，常伴肝脾肿大[3, 13]。
由于NTM多引起肺部感染，而NTM肺病的临床表现与结核病相似，在缺乏菌种鉴定情况下易被误诊为结核病[3, 17]。这两种疾病的发病机制和治疗方案均不相同。NTM对用于治疗结核病的一线和二线药物天然耐药，如对异烟肼、对氨基水杨酸和链霉素的耐药率分别为97.78%、94.87%和94.81%[18]，临床常用抗生素中，NTM耐药率小于30%者有阿米卡星、莫西沙星、利福布汀、头孢西丁和克拉霉素等[19]。此外，不同种类NTM的毒力谱和抗生素灵敏度也不同[20-21]，即使是同一种复合体的NTM也须采用不同的治疗策略。然而，在临床上NTM病多被漏诊或给予结核病常用治疗，不仅耗时耗资、疗效差且可导致耐药NTM菌株进化[1]。因此，准确快速地对NTM进行鉴定，对于NTM病的早期诊断、早期治疗以及疫情控制具有重要意义。
2 NTM鉴定方法 2.1 传统检测方法诊断肺部NTM要求至少2次痰培养阳性，或1次下呼吸道样本（如支气管灌洗液）培养阳性；肺外NTM病的诊断通常需要获取受累部位组织样本进行培养，如诊断淋巴结炎需要切除活检培养或细针抽吸镜检培养，诊断NTM播散性疾病须进行血培养[13]。
传统的分枝杆菌感染诊断依赖于临床表现、组织病理学、抗酸杆菌涂片和从培养物中分离出NTM[22]。由于NTM的细胞壁与MTB相似，含有较丰富的脂类，能与酸性乙醇不能脱色的Carbol-品红染料结合，因此NTM也属于抗酸杆菌[13]。
痰涂片抗酸染色是目前使用最广泛的诊断方法，操作相对容易和快捷，然而灵敏度仅50%~80%，且不能区分分枝杆菌种类。痰培养为传统诊断金标准，灵敏度较高（87.61%）[23]，但耗时长（10~42 d），而且需要复杂的设备[17, 24-25]。
2.2 分子检测学技术实时荧光聚合酶链反应（real-time fluorescence polymerase chain reaction，RT-PCR）、DNA测序、基因芯片技术（gene chip technology，GCT）等分子诊断方法克服了传统检测方法的缺点，检测迅速，提高了菌种鉴定的准确性。《WS 288—2017肺结核诊断》已将分枝杆菌核酸检测纳入结核病病原学检查范畴[26]。中国防痨协会发布的《非结核分枝杆菌病诊断》将基于同源或序列比较的分子生物学方法作为目前鉴定分枝杆菌菌种的金标准[27]。
2.2.1 RT-PCR聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR），包括RT-PCR和巢式PCR（nested PCR, N-PCR），是检测分枝杆菌的有效且简便的方法，仅须3~5 h，较抗酸杆菌培养有更高的特异度和灵敏度[22]。其中，RT-PCR根据不同分枝杆菌基因转录间隔区(internally transcribed spacer, ITS)的特异序列设计探针，采用特定的荧光通道和熔点进行分枝杆菌鉴别，可以检测临床和环境中常见的19种分枝杆菌[28]。与N-PCR相比，RT-PCR不仅提高了灵敏度和特异度，而且由于采用可以降低污染风险的封闭式PCR系统，使假阳性率降低，同时不需要扩增后处理即可同时分析PCR产物，检测程序更简单[29]。一项对238株抗酸菌株的鉴别试验[26]中，相较于传统的对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼（PNB/TCH）生长试验法和MTB抗原（MPB64）检测法，RT-PCR法灵敏度（100.0%）和特异度（100.0%）最高。
RT-PCR熔解曲线法鉴定菌种包括3个步骤：试剂配制、核酸提取、PCR扩增及熔解曲线分析[28]。当扩增通道荧光信号高于背景荧光所须的PCR周期数（周期阈值）少于35个时，结果为阳性[30]。目前常用分枝杆菌RT-PCR试剂盒所检测的基因不同：AdvanSure试剂盒可检测MTB IS6110区和NTM rpoB基因；PowerChek试剂盒针对MTB复合体特异的IS6110基因和分枝杆菌的ITS区域；Anyplex试剂盒则针对MTB IS6110和mpb64基因以及NTM的16S rRNA[24]。其中，Anyplex试剂盒较其他试剂盒更加实惠，或许将来可以取代镜检用于常规诊断[31]。
2.2.2 多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction, mPCR）mPCR是一种在RT-PCR基础上发展的简单快速且可靠的鉴定技术，其原理为在同一PCR反应体系中加入多种DNA序列的特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原体，提高检测效率[32]。进行分枝杆菌mPCR首先需要通过数据库获得MTB及常见NTM序列，确定分枝杆菌属特有的ITS、16S rRNA、rpoB以及hsp65等靶基因，对每个靶基因的保守区和可变区进行分类，并确定关键的部分可变区，据此设计分枝杆菌的特异性引物[7]，经扩增、测序完成[1]。mPCR有高效、低成本、检测快等优点，有较好的可操作性，但引物有限，且引物之间相互抑制会影响扩增，从而影响鉴定结果。
MeltPro Myco检测是一项结合mPCR与多色解链曲线分析的定性诊断技术，可在单个RT-PCR反应中同时检测51种分枝杆菌菌株种属，以及准确识别17种临床常见NTM种，对我国常见脓肿分枝杆菌则可全部正确识别；操作时间短于20 min，周转时间3 h，检测快速，且能直接检测涂片而不需要培养，或许可用于结核病流行地区筛查[33]。
2.2.3 PCR-限制性片段长度（fragment length polymorphism, RFLP）多态性分析（PRA）PRA可在单个实验中简单且廉价地鉴定分枝杆菌种类[34]。该技术已用于分枝杆菌多种基因的识别，如16S rRNA、hsp65、DNAJ、groES、16S-23S rRNA ITS和rpoB基因等。有研究[35]表明，相较于其他基因，hsp65基因的检测一致性最高，对MTB和MAC的检测灵敏度和特异度均为100%，且适用于大规模检测。
PRA具体操作方法：根据试剂盒说明书进行PCR循环后得到的扩增产物用限制性内切酶酶切后，经电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外光下观察菌株特异的图案，每种NTM的限制性片段大小可用标准PRA大小标志来确定[30]。然而，PRA的最大局限为条带长度通过肉眼判断，可能导致鉴定错误[36]。自动化版本有所改善：样品用荧光标记的引物扩增后片段的大小可通过荧光毛细管电泳来评估[34]，进而减少肉眼评估时存在的误差。
伊朗一项rpoB基因的PRA检测研究[37]发现，该方法能鉴定96.6%的分枝杆菌分离株，认为PRA为分枝杆菌种和亚种诊断和分型准确且廉价的方法。总之，PRA是一种灵敏、特异且快速的分枝杆菌检测方法，检测结果与DNA测序一致性达90%[36]，对NTM快速诊断和分枝杆菌菌种鉴定具有重要意义。
2.2.4 PCR反向斑点杂交法（PCR-based reverse blot hybridization assay, PCR-REBA）该方法不仅检测快速、灵敏度和特异度均高，还弥补了PRA混合带型复杂而不能鉴定NTM种的局限性[38]。PCR-REBA Myco-ID®是一种基于16S rRNA测序、核酸探针和反向印迹杂交的试剂盒，可同时对22种临床重要分枝杆菌进行基因分型[39]。具体操作方法：根据试剂盒说明书进行PCR循环，对扩增产物进行反向杂交检测和洗涤，通过染色溶液使杂交信号染色，最后对条带进行解读[38, 40]。
韩国一项研究[30]表明，PCR-REBA检测MTB和NTM的灵敏度分别为100%和97.5%，特异度均为100%。中国一项纳入696份临床样本的研究[39]中，PCR-REBA Myco-ID法对MTB和NTM的特异度和阳性预测值均为100%。PCR-REBA检测快速，循环时间一般不超过4 h，其中包括1 h的DNA制备时间和1.5 h的靶DNA扩增时间[30]。此外，该方法不需要专门设备，成本低。而且，该方法还可以直接对临床样本进行检测。虽然目前未将其作为分枝杆菌的常规检测手段，但其应用潜力大，尤其可用于资源有限的地区[39]。
2.2.5 GCTGCT是建立在基因及基因组测序基础上的分子生物学技术，其原理为针对基因组上保守的序列，设计能与之相结合的探针，二者结合后发出的信号可被荧光检测装置检测到，以此判定该位点基因序列，从而确定菌株类型[41]。NTM的常用GCT鉴定序列包括16S rRNA、hsp65、ITS、rpoB和gyrB等，其中以16S rRNA和hsp65最常用[36]。
GCT通过4个步骤鉴别NTM，即试剂配制、核酸提取、PCR扩增、芯片杂交及扫描分析。相较于传统培养法，GCT可一次性对样本中大量序列进行检测，有明显的时间优势[41]，但技术要求更高，且设备价格昂贵；相较于RT-PCR熔解曲线法，增加了芯片杂交及扫描分析步骤，这一步骤不仅需要更精密的仪器，且增加耗时（3 h）。总之，GCT能正确迅速鉴定分枝杆菌种属，但由于技术要求高、所需仪器昂贵，不适于临床实验室常规开展。
2.2.6 宏基因二代测序（meta genomic next-genera-tion sequencing, mNGS）NGS具有检测快、准确性高、成本低、覆盖面广等特征[2]。NGS通过检测临床样本中的全部核酸片段，经生物信息学分析鉴定样本中核酸的种类，从而获得病原体的序列数、覆盖度等定量数据，完成所有病原菌的鉴定及分型。mNGS无须培养，不须特异度引物，灵敏度高，且利于发现新的病原体[11, 42]。一项对比培养法与mNGS对NTM检出率的回顾性研究[43]显示，两者NTM检测阳性率差异无统计学意义，但mNGS能在24 h内鉴定出NTM及菌种；对于可疑患者，mNGS送检样本检出阳性率为肺泡灌洗液＞肺组织＞痰液，痰液应尽量取深部晨痰。mNGS不仅检测多种样本中NTM快速、灵敏度高，且可检测混合感染病原菌，由此鉴别合并感染，因此，对于疑似NTM病患者，在经济条件允许的情况下，推荐mNGS检测。此外，mNGS还能快速筛选与NTM病发展相关的多个耐药靶基因，从而帮助多重和广泛耐药菌感染患者制定个体化治疗方案[11]。
尽管mNGS已广泛应用于临床，但其存在较多局限：（1）mNGS易受外源污染及检测部位定植菌的影响，因此特异度较低；（2）宿主自身核酸可影响mNGS病原体检测的总体灵敏度，如炎症细胞可使病原体序列数相对减少，从而影响检测效果；（3）mNGS检测价格较昂贵，对于病情反复的患者，多次检测成本高。因此，mNGS目前不能完全取代传统检测方法，其临床应用须进一步优化[42]。
2.3 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS是一种新型电离技术，随着近年来不断发展，目前已能快速有效识别大多数NTM。其原理为根据质荷比，用激光将分枝杆菌蛋白电离，然后将分离株的特征性蛋白谱与已知图谱进行对比，继而鉴别分枝杆菌种[44]。该方法具有灵敏、快速、准确和分辨率高的优点，且较PCR检测全基因组序列更廉价[13-14]。一项比较MALDI-TOF MS与PRA方法检测NTM的研究[10]发现，两者的鉴定准确率相近，分别为97.4%、98%。另一项研究[25]表明，RT-PCR能鉴定MALDI-TOF MS不能鉴定的NTM菌株，而MALDI-TOF MS则能准确鉴定大多数MF、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。因此，RT-PCR和MALDI-TOF MS结合有助于提高NTM鉴定效果，增加诊断和治疗依据。
然而，用该方法鉴别NTM仍有挑战性：（1）需通过特殊的样品处理程序来得到纯净的灭活分离株；（2）易受到仪器可用谱库宽度的限制，如果NTM光谱数量较少，可能还会导致检测不足；（3）分枝杆菌生长慢，核糖体蛋白数量较少，细胞壁蜡质厚且具有疏水性，均影响检测[13, 25, 44]。NTM各种分子生物学检测手段的原理、优缺点等比较见表 1。
| 检测方法 | 原理 | 优点 | 缺点 | 应用场景 |
| RT-PCR | 针对NTM特异序列设计探针，扩增后根据特异荧光通道与熔点进行鉴别 | 灵敏度和特异度高、耗时短 | 需提取核酸及PCR扩增，操作较复杂 | 分枝杆菌的筛查工具，NTM早期发现与治疗 |
| mPCR | 同一PCR反应体系中加入多种DNA序列的特异性引物进行扩增，同时检测多种病原体 | 同时检测多种病原体，高效、低成本、检测快 | 引物之间相互抑制可能影响鉴定结果 | 结核病流行地区的筛查工具，鉴定NTM病 |
| PRA | 结合了PCR扩增和限制性分析，将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切后得到大小不同的限制性片段 | 灵敏、特异、快速 | 肉眼评估存在误差，不能准确鉴定混合感染 | NTM的快速诊断和分枝杆菌菌种鉴定 |
| PCR-REBA | 基于基因测序、核酸探针和反向印迹杂交，对扩增产物进行反向杂交，染色后进行解读 | 快速、灵敏度和特异度高、成本低，可直接在临床标本上操作，能鉴定混合感染 | 操作步骤繁琐 | 区分混合感染样本中不同分枝杆菌的种类 |
| GCT | 针对基因组保守的序列设计能与之相结合的探针，根据结合后发出的信号确定菌种 | 自动化程度高，操作简单、效率高、快速 | 耗时长，技术要求高，所需仪器昂贵 | 正确迅速地鉴定出具体的分枝杆菌种属，帮助临床医生早期诊断NTM并制订合理的治疗方案 |
| mNGS | 检测标本中的全部核酸片段，经分析完成所有病原菌的鉴定及分型 | 不须特异度引物，灵敏度高，能鉴别多重感染，耗时短，能筛选耐药基因 | 价格昂贵，特异度较低，易受到干扰 | 对多重感染及广泛耐药患者具有显著优越性，帮助制定个体化治疗方案 |
| MALDI-TOF MS | 根据质荷比，用激光将分枝杆菌蛋白电离，然后将分离株的特征性蛋白谱与已知图谱进行对比 | 灵敏、快速、准确、分辨率高 | 特殊的样品处理程序，受到仪器可用谱库宽度的限制，蛋白获取复杂 | 与RT-PCR结合帮助识别遗漏的NTM种类，为患者的诊断和治疗提供证据 |
随着结核病疫情逐步得到控制、检测技术的不断发展及临床医生对NTM的进一步了解，NTM病的检出率逐步上升，在某些地区甚至超过结核病。NTM微生物学特性与MTB相似，可引起与MTB相似的临床症状，易导致误诊，因此快速、准确鉴定NTM有重要意义。
传统培养法操作繁琐、费时，而且灵敏性和特异度不高。而分子诊断技术在NTM鉴定方面具有快速、准确、重现性好等优势，包括RT-PCR法、mPCR、PRA、PCR-REBA等。RT-PCR法简单、快速、高效，对NTM病的诊断具有重要参考意义，在此基础上发展的mPCR、PRA、PCR-REBA等也已显示出不错的鉴定效果，但仍需进一步研究。基因芯片法可用于鉴别合并感染及筛选耐药靶基因。mNGS具有监测效率高、灵敏度高、覆盖面广等多面优势。然而，这些方法在鉴定NTM方面均有其缺点。作为临床医生，应进一步加强对NTM的认识，对疑似感染患者积极排查，并根据检测条件和患者实际情况选用NTM检测手段。同时，更快速、灵敏、准确的NTM诊断技术或手段有待进一步探讨。
利益冲突： 所有作者声明不存在利益冲突。
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