多重耐药(multidrug resistance, MDR)菌引起的重症肺炎(severe pneumonia, SP)是ICU内最常见的呼吸系统疾病或危重症患者的合并症之一。患者病情进展快,处理不及时可发展为多器官功能障碍综合征(MODS)[1-2],治疗困难、治疗周期长、死亡率高,需要联合使用限制级抗生素、多种生命支持手段。该类住院患者平均病死率为50%~60%,是ICU患者死亡的主要原因,且病死率未随着抗生素的发展而下降[3-4]。
中性粒细胞胞外网状陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞坏死或凋亡后形成的蛋白酶类、抗菌肽等形成的网状结构,构成了中性粒细胞的第二重杀菌屏障,可在细胞外捕获并杀死细菌,参与机体免疫应答[5]。近年来,多项研究[6-9]显示,NETs与炎症介质协同促进肺部相关疾病的发生和发展,提示其对于肺部疾病的预防和治疗具有重要意义。但是目前鲜见关于MDR菌引起SP患者NETs水平改变的相关报道。
因此,本研究拟通过分析该类患者血浆NETs水平,探讨NETs与该类患者病情严重程度及预后的关系,从而为该类患者体内病原体清除、免疫屏障功能状态评估及个体化药物治疗提供参考。
1 资料与方法 1.1 一般资料根据SP患者中MDR菌引起者占约30.8%[10],失访率10%,MDR引起的SP统计样本量应大于30例,因此至少须纳入109例SP患者。前瞻性纳入2020年11月至2022年8月在复旦大学附属中山医院急诊重症监护室及急诊病房接受诊治的171例SP患者作为研究对象,其中男性126例、女性45例,年龄12~92岁,平均(65.72±16.17)岁,分为MDR组(n=86)和non-MDR组(n=85)。SP依据《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[11]诊断。MDR感染依据痰培养或肺泡灌洗液药敏结果诊断,即对3类抗生素中至少1类存在获得性不敏感[12]。排除标准:(1)存在其他部位感染,如中枢神经系统感染、血流感染、腹腔感染、泌尿道感染、皮肤软组织感染;(2)严重肝肾功能衰竭、心源性休克、血液系统疾病、精神系统疾病。本研究获得本院伦理委员会审批(B2020-016),所有研究对象均已签署知情同意书。
1.2 观察指标收集两组患者临床资料及实验室指标,包括性别、年龄、基础疾病(COPD/糖尿病)、白细胞计数(white blood cell, WBC)、中性粒细胞百分比(neutrophil percentage,N)、序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment, SOFA)[13]、急性生理与慢性健康评分系统Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHEⅡ)评分[14]、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、降钙素原(procalcitonin, PCT)、病原体培养及药敏结果、28 d生存率等。
1.3 NETs检测所有患者入院第1天抽取全血7 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,1 500×g室温离心10 min,将上层清液转移至新的离心管中,1 500×g室温离心10 min,取上清即获得血清,-80℃保存备用。
由于循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cf-DNA)是有效反映NETs水平的间接血清学标志物[15],以此来表示NETs水平。采用Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA Assay Kits-dsDNA检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific),将血清稀释5倍用于测量,参照标准曲线计算cf-DNA水平。
1.4 统计学处理所有数据均采用R 4.2.0软件进行分析,连续变量以x±s描述,组间比较采用t检验。分类变量以n(%)描述,组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。所有检验均为双侧。采用Pearson相关性检验检测连续变量间相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析受试者生存率,并采用log-rank检验进行组间比较。采用Cox比例风险模型分析生存影响因素,同时根据模型的赤池信息量准则(AIC)确定Cox回归多因素模型。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 临床基线资料结果(表 1)显示:MDR组和non-MDR组患者性别、年龄、基础疾病(COPD或糖尿病)、WBC、N、CRP、PCT差异无统计学意义;MDR组SOFA评分、APACHEⅡ评分、NETs水平高于non-MDR组(P<0.01)。
项目 | MDR组(n=86) | non-MDR组(n=85) | χ2/t值 | P值 |
年龄/岁 | 65.00±16.96 | 66.45±15.40 | -0.584 | 0.600 |
性别(男/女) | 67/19 | 59/26 | 1.591 | 0.207 |
COPD(男/女) | 20/66 | 23/62 | 0.328 | 0.567 |
糖尿病(男/女) | 10/76 | 13/72 | 0.494 | 0.482 |
SOFA评分 | 9.50±4.21 | 7.66±3.55 | 3.087 | 0.002 |
APACHEⅡ评分 | 24.40±6.74 | 17.58±6.15 | 6.907 | 0.001 |
WBC (×109/L) | 12.28±7.21 | 11.35±7.21 | 0.833 | 0.401 |
N/% | 85.88±8.74 | 83.81±13.26 | 1.218 | 0.230 |
CRP/(mg·L-1) | 177.25±162.38 | 165.25±158.62 | 0.489 | 0.626 |
PCT/(ng·mL-1) | 189.45±1 616.10 | 14.51±29.11 | 0.998 | 0.318 |
NETs/(ng·mL-1) | 6 342.93±2 642.34 | 3 152.65±1 364.53 | 9.936 | 0.001 |
MDR组患者共分离86株MDR,其中革兰阳性菌13株(15.1%),均为金黄色葡萄球菌;革兰阴性菌73株(84.9%),包括鲍曼不动杆菌36株(41.9%)、铜绿假单胞菌16株(18.6%)、肺炎克雷伯菌14株(16.3%)、嗜麦芽窄食单胞菌7株(8.14%)。Non-MDR组患者共分离80株病原体,其中革兰阳性菌16株(20%),包括金黄色葡萄球菌4株(5%)、屎肠球菌4株(5%)、肺炎链球菌8株(10%);革兰阴性菌58株(72.5%),包括铜绿假单胞菌8株(10%)、大肠埃希菌8株(10%)、副流感嗜血杆菌8株(10%)、肺炎克雷伯菌16株(20%)、鲍曼不动杆菌18株(22.5%);真菌6株(7.5%),均为白色念珠菌。
2.3 NETs与SP其他临床指标的相关性分析结果(表 2)显示:NETs与SP患者的SOFA评分、APACHEⅡ评分正相关(P<0.01),与年龄、WBC、N、CRP、PCT无相关性。
参数 | r值 | P值 |
年龄 | -0.023 | 0.764 |
WBC | 0.05 | 0.514 |
N | 0.039 | 0.605 |
APACHEⅡ评分 | 0.408 | 0.001 |
SOFA评分 | 0.202 | 0.008 |
CRP | 0.012 | 0.864 |
PCT | -0.035 | 0.651 |
Kaplan-Meier生存曲线(图 1)显示:MDR组与non-MDR组患者的28 d生存率分别为58.48%、84.70%(P=0.000 3);按照MDR组病原学结果分组,各亚组间生存率差异无统计学意义。
2.5 SP患者生存率的Cox比例风险模型预测单因素分析(表 3)显示:NETs和分组影响患者预后(P<0.01);将NETs以1 000为基准单位进一步分析,发现NETs每上升1 000倍,患者死亡风险提高16%。将所有因素纳入多因素模型,并采用AIC衡量,避免共线性因素,得出最小AIC(463.32)的模型,结果(表 3)显示:分组和SOFA评分是SP患者生存的独立影响因素(P<0.05)。
参数 | 单因素分析 | 多因素分析* | |||||
P值 | HR | 95%CI | P值 | HR | 95%CI | ||
分组(non-MDR组vs MDR组) | <0.001 | 0.328 | 0.173~0.620 | 0.000 1 | 0.288 | 0.151~0.548 | |
性别(女vs男) | 0.777 | 0.910 | 0.473~1.749 | ||||
年龄 | 0.401 | 1.008 | 0.989~1.028 | ||||
SOFA | 0.118 | 0.946 | 0.882~1.014 | 0.019 0 | 0.923 | 0.853~1.000 | |
APACHEⅡ | 0.952 | 1.001 | 0.963~1.041 | ||||
WBC | 0.688 | 1.008 | 0.968~1.050 | ||||
N | 0.449 | 1.012 | 0.981~1.043 | ||||
CRP | 0.314 | 1.001 | 0.999~1.002 | ||||
PCT | 0.149 | 1.000 | 1.000~1.025 | ||||
NETs | 0.002 | 1.000 2 | 1.000 1~1.000 2 | ||||
NETs (×1 000) | 0.002 | 1.161 | 1.058~1.276 | ||||
*AIC衡量,AIC=463.32。 |
MDR菌引起的SP具有较高的发病率和致死率,由于感染更加复杂,临床治疗难度更大[16]。本研究显示,MDR菌引起SP的最常见病原体为革兰阴性菌,虽然根据药敏结果选择合适的抗生素治疗,但MDR组的28 d生存率仅为58.48%,低于non-MDR组(84.70%,P=0.000 3)。因此尽早识别此类SP,从而进行个体化治疗已成为临床亟待解决的问题。
作为固有免疫系统的效应细胞,中性粒细胞是抵御外来微生物入侵人体的第一道屏障。中性粒细胞主要采用3种方式对抗微生物,包括吞噬、脱颗粒和释放NETs。NETs是染色质纤维与颗粒衍生的抗菌肽和酶混合而成的网状结构,可在细胞外捕获并杀死细菌,参与机体免疫应答[17]。致病因素通过不同途径激活中性粒细胞及单核巨噬细胞,衍生的小分子高迁移率族蛋白b1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)通过单核巨噬细胞级联反应,参与机体的防御反应[18]。而动物实验[19]表明,NETs通过依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的调节凋亡机制诱导巨噬细胞死亡,即NETs通过驱动HMGB1活化晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)和动力蛋白依赖性信号传导通路,使破裂的溶酶体释放组织蛋白酶B,促进焦亡小体形成和caspase-1活化,最终导致巨噬细胞死亡。NETs在感染性肺部疾病和非感染性肺部疾病中发挥重要的抗感染作用,可以捕杀多种病原体,包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌、病毒、寄生虫等[20]。而作为一把双刃剑,NETs包含的蛋白酶及细胞外组蛋白均可直接损伤肺泡内皮细胞和上皮细胞,同时可作为潜在的自身抗原刺激浆细胞样树突细胞释放干扰素,导致自身组织和器官功能损伤[7, 21-23]。
本研究中,MDR组NETs水平高于non-MDR组,提示NETs可能与多重病原体感染相关,而级联产生的NETs持续损伤组织,破坏免疫屏障,加剧了多重耐药性的产生。APACHEⅡ评分和SOFA评分越高,SP预后越差。本研究显示,NETs与APACHEⅡ评分、SOFA评分正相关,提示NETs可作为评估SP严重程度的有效指标。单因素Cox分析显示NETs影响SP患者的预后;多因素Cox分析虽然未证实NETs为影响SP患者生存的独立因素,但显示SOFA评分为影响SP患者生存的独立因素,而NETs与SOPA评分正相关,不能排除本研究统计偏倚,仍需更大样本量进一步明确NETs对SP患者预后的预测价值。
综上所述,本研究发现,NETs在MDR菌引起的SP患者中显著升高,并影响患者生存,提示早期及时监测NETs有助于评估该类患者的炎症反应程度和免疫功能状态,从而指导临床使用抗生素及进行免疫调节治疗,进而改善患者预后,而合理平衡NETs形成可能成为未来SP治疗的方向之一。
利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突。
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