碳青霉烯类药物是多重耐药的革兰阴性菌感染的首选抗生素^[1]。近年来，全球碳青霉烯类药物大量使用导致革兰阴性菌对其耐药性日趋严重^[2]。2015年，美国疾病控制中心将耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriales，CRE)定义为产碳青霉烯酶，或耐至少一种碳青霉烯类抗生素(多利培南、厄他培南、美罗培南或亚胺培南)的肠杆菌目细菌^[3]。近年来，我国对CRE的分离率逐年递增，2020年CHINET细菌耐药监测网研究^[4]显示，肠杆菌目细菌对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别从2005年的3.1%和2.1%升至2020年的10.7%和10.5%，其中肺炎克雷伯菌对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别从2005年的3.0%和2.9%升至2020年的25.5%和27.1%。

CRE广泛传播已成为全球范围内严重的公共卫生威胁^[4]。严重的CRE感染，尤其是CRE血流感染，可导致高达70%的死亡率^[5]。CRE常见耐药机制为产碳青霉烯酶，而目前国内用于治疗CPE的抗生素有限，主要包括多粘菌素类、替加环素和头孢他啶-阿维巴坦。其中，多粘菌素类具有较大的肾毒性^[6]，且约有13%的肺炎克雷伯菌感染患者对其产生异质性耐药^[7]；替加环素用于治疗复杂皮肤和腹腔感染，但可引起凝血功能障碍、肝功能损害^[8]等严重不良反应。2019年我国批准了头孢他啶-阿维巴坦用于治疗CRE感染。头孢他啶-阿维巴坦对产A类、C类丝氨酸酶及D类中的OXA-48型CRE治疗效果显著，且导致的不良反应较少，但是对B类金属β内酰胺酶无抑制效果^[9]。目前国内使用的商品化药敏板条还未包含对头孢他啶-阿维巴坦的检测，仅药敏纸片方法获得批准，但准确性不高^[10]，而微量肉汤稀释法成本较高且操作相对复杂，难以在所有实验室推广，因此进行准确可靠的碳青霉烯类耐药基因检测，对协助临床合理使用头孢他啶-阿维巴坦至关重要。

碳青霉烯酶基因按其分子结构可分为A类丝氨酸酶、B类金属蛋白酶和D类丝氨酸酶。A组活性位点为丝氨酸，能被3-氨基苯硼酸抑制，常见基因型为KPC、IMI、GES和NMC；B组活性位点为金属锌离子，可被EDTA抑制，常见基因型为VIM、IMP、GIM、NDM等；D组也为丝氨酸酶，主要基因型为OXA型。其耐药基因分型检测方法主要包括表型、分子生物学、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaser desorption lnoization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测(表 1)。

1 碳青霉烯酶表型检测 1.1 改良Hodge实验(modified hodge test，MHT)

MHT为2009年美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的第1个碳青霉烯酶筛选方法。该方法以指示菌株和试验菌株在抑制与生长交界处的指示剂生长是否增强为依据，判断试验菌株对抗生素是否具有抑制作用^[11]。这种方法的优点为易于执行、成本低、不需要专门的试剂，且检测CRE中的KPC酶具有较高的灵敏度和特异度。但其检测B类金属蛋白酶的灵敏度较低(＜50%)^[12]，且对操作者要求较高。此外，应用该方法时，产AmpC酶肠杆菌目细菌的存在易导致假阳性，而产NDM酶肠杆菌目细菌的存在易导致假阴性^[13]。因此，CLSI于2018年不再推荐将此方法用于检测CRE表型。

1.2 Carba NP实验

2015年CLSI推荐Carba NP实验用于检测肠杆菌目和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶，现已有商品化试剂盒。其中，Rapidec Carba NP测试易于操作和结果解释，相对便宜，能在30 min~2 h得到结果^[14]。但是，该试验结果分析存在主观影响。而且，有研究^[15]显示，有30%的麦康凯平板分离菌株不准确，这可能由培养基中乳糖发酵和乳酸产生影响反应体系的pH值所致。同时，该方法对产OXA-48和GES-5的碳青霉烯酶检测灵敏度较低^[16-19]。

1.3 改良的碳青霉烯类灭活(modified carbapenem inactivation method，mCIM)实验和EDTA改良碳青霉烯灭活(EDTA-modified carbapenem inactivation method，eCIM)实验

2017年，CLSI将mCIM和eCIM试验纳入抗生素敏感试验执行标准^[20]，用于检测CRE产酶情况。mCIM和eCIM方法易检测碳青霉烯酶分型，且操作简单、判断结果标准、成本较低，成为临床微生物实验室碳青霉烯类肠杆菌推荐检测方法。Sfeir等^[21]研究表明，mCIM和eCIM检测CRE产酶型别的灵敏度和特异度均为100%。两种方法的缺点均为耗时较长，至少需要22 h才能获得结果，且抑菌圈内易产生针尖状菌落，从而干扰结果判读。

1.4 分光光度计法

Takeuchi等^[22]开发一种双波长测量方法：将25 μg/mL亚胺培南和细菌配置成吸光度为297 nm的悬液，通过检测亚胺培南水解后悬液的吸光度来判断菌株对亚胺培南的反应程度。亚胺培南在297 nm处显示出最大吸收峰，水解后吸收降低，亚胺培南悬液浓度越高，吸光度越高。水解30、60、90、120 min后，根据细菌产不同基因型碳青霉烯酶活性时间判断产酶情况。其中KPC型最短约须30 min，NDM、IMP型须60~90 min；OXA型常由于含量少而不易检测，易出现假阴性结果。该方法的优势在于节省时间，制备悬液和孵育约40 min(OXA的检测时间适当延长)，且在相同的孵育时间内较Carba NP有更高的灵敏度和特异度，与mCIM结果一致性较好。但是，分光光度计法须特定仪器(分光光度计)，而且不适用于大样本量检测，限制了其临床推广应用。

1.5 酶抑制剂增强试验

该方法将3-氨基苯硼酸和EDTA分别作为丝氨酸酶和金属β内酰胺酶抑制剂^[23]：加与不加3-氨基苯硼酸试剂的亚胺培南纸片抑菌圈直径差≥5 mm，表示产丝氨酸酶；加与不加EDTA试剂的亚胺培南纸片抑菌圈直径差≥5 mm，则表示产金属β内酰胺酶。此方法操作简单，易开展，无需其他仪器及耗材，步骤较少，可检测产丝氨酸酶、金属β内酰胺酶或同时产该两种酶的CRE。但是，该方法无法区分A类或D类酶，且以纯菌落进行试验，培养18 h后才能得到结果，当耐药基因不表达或低表达时存在假阴性结果。

1.6 免疫层析方法

免疫层析方法是一种以抗原抗体结合为基础检测碳青霉烯酶的方法。该方法操作简单，可以在15 min内快速、准确地从培养物中鉴定KPC、NDM、OXA-48等分型菌株，其灵敏度和特异度分别为98.1%和100%^[24]，且不受培养基种类的影响，但需要通过增加接种量来提高某些型别的检出率。目前，免疫层析方法仅能用于检测特定几种酶型，且试剂成本高。

2 分子生物学检测方法 2.1 耐药基因精准检测

PCR可用于准确识别一类已知耐药基因的基因型，但需要特殊的实验室条件和设备，且只针对目标基因，易出现假阴性^[25-27]。

2.2 高通量测序技术(next-generation sequencing technology，NGS)

NGS是一种可同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。

2.2.1 纯菌落的宏基因组测序

宏基因组测序属于新型病原体检测手段，已广泛应用于临床。对从标本分离的CRE纯菌落进行检测，通过将目标DNA片段碎片化，对小片段核酸进行扩增和测序，运用计算机算法获得CRE的完整序列^[28]，通过与数据库比对获得耐药基因。宏基因组测序技术对碳青霉烯表型检测灵敏度高，能有效减少采样次数，且其检测时间较传统培养明显缩短。但该方法操作要求较高，且需要特殊仪器^[29]，目前还缺乏统一的前处理流程、标准化数据处理和分析，需要减少环境中的核酸污染，并防止病原菌在运输和保存过程中降解^[30]。

2.2.2 二代测序

将微生物全基因组建库，将样品的数据进行组装，随机从组装结果中挑选较长的片段，与美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)的基因组数据库数据进行比对，同时与耐药基因数据库(comprehensive antibiotic resistance database，CARD)数据进行比对^[31]。NGS具有较高的灵敏度，在疾病诊断、治疗、预防及耐药基因检测等方面都有很好的应用效果。NGS可直接对标本进行检测，获得耐药基因序列，但易受外界干扰，标本采样、运送，处理试剂过程中及实验室环境都可能受到污染，且无法区别耐药基因来源于致病菌或定殖菌^[32]。当患者病程中产生较大的免疫反应时，样本中高浓度炎症细胞会使病原体的序列数减少^[33]，影响检测效果。目前对于测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况等诊断影响因素缺乏规范要求，同时需要完善未知病原菌和新型耐药基因数据^[34]。

2.3 Xpert Carba-P

该方法是一种定性多重实时PCR方法，可在1 h左右直接从直肠拭子或纯化菌落中检测出5种常见碳青霉烯酶基因(KPC、NDM、VIM、OXA-48、IMP)。此方法更适用于来自下呼吸道的标本，其检测KPC和NDM基因型较为敏感，但对于VIM和IMP基因型的检测效果较差，无法检测大肠杆菌中的VIM基因型、仅能检测66.7%肺炎克雷伯菌IMP基因型^[35]。该方法操作简单，所需时间短，且对KPC的检测较表型检测方法不易出现假阴性情况。但该方法所用仪器和试剂较为昂贵，而且，患者接受抗生素治疗后，可能携带未表达或低表达的目标基因修改序列，从而导致假阳性结果^[36]。由于Xpert Carba-P除试剂盒允许的样本种类外，其他标本经过处理后也可选择性进行检测，目前已逐步在临床开展。

3 MALDI-TOF MS 3.1 美罗培南水解实验(meropenem hydrolysis assay，MHA)

混合特异性酶和水解底物后，使用质谱法检测底物的特征峰在383.5、405.5、427.5 nm处是否消失或位置是否改变来判断酶是否存在，用于检测肠杆菌目和鲍曼不动杆菌。这种方法可以同时鉴定细菌和碳青霉烯酶分型，有研究^[37]显示，此方法仅需要60 min的孵育即可成功检测出95%丝氨酸酶和87%金属蛋白酶。但与传统药敏平板培养出的纯菌落检测方法相比，MALDI-TOF MS直接对标本进行鉴定，而细菌浓度低不易检测，特征峰易受细菌本身蛋白质干扰，从而导致假阴性结果，且检测操作繁琐^[38-39]。

3.2 特异质谱峰检测方法

质谱图像中，不同酶的峰值在不同位置，因此可以通过图像的峰值位置区间间接判断分离菌产酶情况。此方法快速简便，无需另外的操作步骤即可得到结果，但需要昂贵的质谱仪器^[40]。由于不同细菌中含耐药基因的质粒大小和类型具有地区差异性，不同地区分离的耐药菌碳青霉烯酶的特异性峰值各不相同，该方法具有局限性。

3.3 直接靶板微滴生长法(direct-on-target microdroplet growth assay, DOT-MGA)

将3 μL美罗培南溶液、3 μL美罗培南和3-氨基苯硼酸混合液、3 μL美罗培南和EDTA混合液，分别与3 μL待测菌液(最终浓度约为5×10⁵ CFU/mL)混匀，滴于MS靶板检测孔内(每孔混合液体为6 μL)，在(35±1)℃湿润环境中孵育3~4 h后，通过MALDI-TOF MS进行检测。根据丝氨酸碳青霉烯酶可被3-氨基苯硼酸抑制、金属β-内酰胺酶可被EDTA抑制的原理，美罗培南和菌液混合的检测孔能检测到待测菌表示细菌产碳青霉烯酶，美罗培南和3-氨基苯硼酸混合的检测孔能测到待测菌表示细菌产丝氨酸酶，美罗培南和EDTA混合的检测孔能检测到待测菌表示细菌产金属β内酰胺酶^[41-42]。

4 小结

多重耐药菌感染时，临床有使用头孢他啶-阿维巴坦的迫切需求。快速、准确、可操作性强的耐药酶型检测对改善临床CRE感染相关治疗效果及患者预后有重要作用。对于肠杆菌目碳青霉烯酶检测方法，临床微生物实验室应从检测结果重复性好、操作流程简易、经济成本低、结果易判读、检测快速等因素考虑和选择。

本文通过对比各个试验的优缺点，目前推荐使用酶抑制剂增强试验，尤其推荐基层临床微生物实验室采用，虽然需要18 h才能得到结果，但其操作简单、成本低，且不需要其他特定设备和试剂，简单培训后即可操作。随着技术的发展，免疫层析方法和Xpert Carba-P用于快速检测CRE分型正逐步向临床微生物实验室推广，检测时间较短，有助于快速优化患者用药，进而提高临床疗效。临床微生物实验室应因地制宜建立适合本实验室的耐药酶型检测流程，积极满足临床要求，配合临床工作，为临床合理用药提供依据。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。