2021, Vol. 28
2. 复旦大学附属中山医院生物治疗中心, 上海 200032;
3. 复旦大学附属中山医院厦门医院肿瘤内科, 厦门 361015
2. Department of Biotherapeutic Center, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. Department of Medical Oncology, Xiamen Branch, Zhongshan Hospital, Fudan University, Xiamen 361015, Fujian, China
肿瘤发生、发展与机体免疫功能失调密切相关。肿瘤免疫逃逸是肿瘤十大特征之一[1]，不仅调控肿瘤的发生、发展，而且影响肿瘤细胞对免疫治疗的应答。体外扩增的自体T细胞过继免疫治疗对实体恶性肿瘤有一定的临床疗效[2-3]。但这种疗法也有不足之处，如过继转移的T细胞不能充分迁移进入肿瘤微环境、过继转移T细胞功能持久性较差等。免疫治疗的疗效还依赖于肿瘤微环境内免疫调节细胞的相互作用，进入实体瘤内部的T细胞会受到肿瘤微环境中各种免疫抑制调节细胞，如骨髓来源抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Tregs)、细胞因子，以及免疫抑制分子程序性死亡因子-1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)等的影响，从而限制其杀伤功能。因此，调节肿瘤患者免疫抑制微环境，使用解除免疫抑制的药物，更好地发挥T细胞的功能，是很好的联合治疗策略。
过继转移的T细胞表达PD-1等免疫检查点受体。与PD-1低表达的过继转移T细胞相比，PD-1高表达的T细胞产生较少的效应细胞因子，如γ干扰素(IFN-γ)。此外，过继转移的T细胞不能充分迁移到肿瘤微环境中，且功能低下，阻断PD-1可增加过继转移的T细胞向肿瘤部位迁移[4]。本研究的前期体外细胞实验结果显示，与传统IL-2、IL-15诱导的体外扩增培养T细胞67.1%的杀伤效应相比，加入PD-1单抗孵育刺激后的T细胞杀伤功能增强到79.4%，而增殖功能无明显改变。因此，我们将这种T细胞命名为“新型T细胞”。目前PD-1单抗孵育刺激的新型T淋巴细胞治疗仍缺少相关临床实践数据。因此，本研究拟探讨PD-1单抗、IL-2以及IL-15诱导的新型自体T细胞治疗实体肿瘤的效果及安全性，为后续临床应用提供参考。
1 资料与方法 1.1 研究对象选择2018年3月至2020年12月复旦大学附属中山医院收治的经病理学确诊的晚期实体肿瘤患者10例，探讨新型T细胞单独使用或联合标准治疗的疗效与安全性。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(B2017-089R2)。研究分为2个队列，队列1(n=3)：标准治疗失败后的晚期实体肿瘤患者，入组后单独使用新型T细胞免疫治疗；队列2(n=7)：晚期实体肿瘤患者，在接受临床标准治疗(包括但不限于化疗、PD-1/PD-L1单抗、靶向治疗等)的同时联合新型T细胞免疫治疗。
1.2 细胞制备及回输患者签署知情同意书，筛选合格后，进行细胞制备。细胞制备时间约2周。第0天：进行细胞单采，单采前需要停止化疗至少1周，停用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)至少2周。每个疗程需采集患者外周静脉血60 mL或进行外周血单细胞采集，获得至少1.0×109个细胞。进行细胞计数、细胞活力检测，加入血清替代物、IL-15、CD3/CD28磁珠铺板。第2天：加入血清替代物、IL-2、IL-15继续培养。第3~7天：用含有IL-2、IL-15、血清替代物的培养基半量换液、扩大培养，加入20 μg/mL PD-1单抗(pembrolizumab)。第8天：去除旧磁珠，加入新磁珠，期间进行活细胞计数、细菌培养，检测支原体、内毒素、细胞表型。第9~12天：用含有IL-2、IL-15、血清替代物的培养基半量换液、扩大培养。第13天：去除磁珠、转入细胞培养袋，抽取部分细胞完成终产品质量控制，进行细胞有效性(包括活力、计数以及表型及功能)测定及细胞安全性检测(细菌、支原体、内毒素)测定，确认达标后可进行回输。回输细胞剂量为2.0×109个起，每3天1次，3~4次为1个疗程，1个疗程总细胞输注剂量为6.0×109~8.0×109个。
1.3 随访评估研究的主要终点指标为安全性，即28 d内细胞治疗相关不良反应发生率及严重程度(根据CTCAE 4.03评估)；次要终点指标为疗效，包括EORTC QLQ-C30 (Version 3)生活质量调查问卷评价生活质量(quality of life，QOL)与无进展生存(progression free survival，PFS)。其他指标包括回输细胞活力、患者免疫功能变化。
1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行数据统计、分析及绘图。正态分布数据以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以n(%)表示。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 一般资料分析结果(表 1)显示：10例患者年龄46~73岁，中位年龄56岁，男性患者9例、女性患者1例。其中肠道肿瘤5例、肝细胞肝癌3例、胰腺癌1例和肺癌1例。
| 编号 | 性别 | 年龄/岁 | PS | 肿瘤类型 | 肿瘤负荷/mm | 联合方案 | 治疗线数 | 8周时疗效评估 | PFS/月 |
| 1-1 | 男 | 50 | 1 | 肝细胞肝癌 | 52 | — | 3 | PD | 2 |
| 1-2 | 男 | 50 | 1 | 肝细胞肝癌 | 54 | — | 4 | PD | 2 |
| 1-3 | 男 | 46 | 1 | 肝细胞肝癌 | 28 | — | 3 | PD | 2 |
| 2-1 | 男 | 57 | 2 | 胰腺癌 | 74 | 化疗 | 4 | PD | 2 |
| 2-2 | 男 | 55 | 2 | 阑尾癌 | 10 | 化疗 | 1 | CR | >19 |
| 2-3 | 男 | 73 | 3 | 小细胞肺癌 | 72 | 靶向药 | 3 | PR | 3 |
| 2-4 | 男 | 41 | 1 | 十二指肠癌 | 15 | PD-1单抗 | 1 | CR | >7 |
| 2-5 | 女 | 64 | 1 | 结肠癌 | 10 | 化疗 | 2 | SD | >7 |
| 2-6 | 男 | 67 | 1 | 结肠癌 | 157 | PD-1单抗 | 3 | PR | >4 |
| 2-7 | 男 | 59 | 1 | 结肠癌 | 15 | 化疗 | 2 | SD | >3 |
| PS：体力状况评分，采用美国东部肿瘤协作组活动状态评分；肿瘤负荷：按照RECIST 1.1标准，选择最大的2个靶病灶的最大径相加；PFS：无进展生存期。 | |||||||||
在肿瘤控制方面，队列1中3例患者均在治疗8周复查评估时出现肿瘤进展；队列2的7例患者治疗后8周时疾病控制率(disease control rate，DCR)达到85.7%(6/7)。队列2中有5例(71.4%)疾病控制良好，至随访结束，未见肿瘤进展证据；另2例为多线治疗失败后晚期肿瘤，虽采用了积极的联合治疗，但最终结局不佳。其中1例患者(编号2-1) 治疗后CA19-9下降明显，但8周时疾病进展；另1例肺癌患者(编号2-3)，治疗8周后肿瘤缩小，但之后迅速进展，PFS仅3个月。
2.2 T细胞鉴定在回输细胞中，新型T细胞活力平均达85.6%(78.6%~96.6%)；T细胞(CD3+)纯度平均达到93.6%(75.7%~99.7%)，其中辅助T细胞群(CD3+CD4+)比例平均为36.9%，细胞毒性T细胞群(CD3+CD8+)比例平均达48.0%(16.3%~75.9%)。
2.3 疗效及安全性 2.3.1 主要指标结果(表 2)显示：在细胞输注后28 d内，未发生与细胞治疗有关的严重(≥3级)不良事件。常见的输注相关不良反应为发热(20%)，2例患者第1次输注后出现1级发热，自行消退。
| n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| 不良事件 | 总计 | TRAE | |||||||||||||||||||||||||||
| 发热 | 2(20) | 2(20) | |||||||||||||||||||||||||||
| 白细胞下降 | 6(60) | 1(10) | |||||||||||||||||||||||||||
| 贫血 | 6(60) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| 血小板减少 | 3(30) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| 甲状腺功能异常 | 2(20) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| 呕吐 | 3(30) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| 腹泻 | 1(10) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| 转氨酶升高 | 3(30) | 0(0) | |||||||||||||||||||||||||||
| TRAE：T细胞输注治疗相关不良事件。 | |||||||||||||||||||||||||||||
生活质量调查问卷调查结果(表 3)显示，细胞免疫治疗后，患者躯体功能、总体健康状况、疲倦改善较为明显(P < 0.05)。
| 指标 | 细胞回输前 | 细胞回输28 d后 | 改善值 | P值 |
| 躯体功能 | 62.50±17.50 | 75.13±14.88 | 12.63±9.47 | 0.01 |
| 角色功能 | 61.25±15.50 | 70.13±12.41 | 8.88±8.88 | 0.03 |
| 情绪功能 | 75.00±6.00 | 83.38±6.47 | 8.38±4.38 | ＜0.01 |
| 认知功能 | 85.38±10.97 | 89.50±10.50 | 4.13±6.19 | 0.12 |
| 社会功能 | 66.63±16.72 | 76.00±15.50 | 9.38±7.38 | 0.02 |
| 总体健康状况子量表 | 63.38±11.38 | 76.00±5.50 | 12.63±6.38 | ＜0.01 |
| 疲倦 | 72.50±16.50 | 86.25±11.69 | 13.75±8.94 | 0.01 |
| 恶心呕吐 | 87.50±12.50 | 89.63±12.97 | 2.22±7.19 | 0.58 |
| 疼痛 | 79.13±13.34 | 85.38±10.97 | 6.25±7.82 | 0.08 |
| 呼吸困难 | 70.88±21.84 | 79.38±15.47 | 8.50±12.75 | 0.17 |
| 失眠 | 70.88±13.34 | 79.25±12.25 | 8.38±10.47 | 0.11 |
| 食欲丧失 | 68.75±10.69 | 79.25±12.25 | 10.50±10.50 | 0.05 |
| 便秘 | 70.75±12.25 | 79.25±12.50 | 8.50±10.63 | 0.10 |
| 腹泻 | 85.25±7.38 | 87.25±6.38 | 2.00±3.50 | 0.35 |
| 经济困难 | 77.13±10.13 | 75.13±10.16 | -2.00±3.50 | 0.35 |
检测7例患者治疗前后外周血中免疫细胞亚群，发现在治疗有效的5例患者(编号2-2、2-4、2-5、2-6、2-7)中，外周血CD4+CD25+ Treg比例相对较低，治疗前为(1.66± 0.57)%、治疗后28 d为(1.68±0.68)%；另2例治疗无效的患者(编号2-1、2-3)治疗前后Treg均处于较高水平，治疗前为(3.04±0.43)%，治疗后28 d为(3.62±0.28)%。2组治疗后28 d CD4+CD25+Treg水平差异有统计学意义(P=0.03)。
3 讨论过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性或非特异性“抗肿瘤免疫效应细胞”，直接杀伤肿瘤细胞或改善提高机体免疫功能来治疗肿瘤的方法。细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer，CIK)是过继性细胞治疗之一，是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子共培育而获得的一群异质性细胞。其中，CD3+CD56+细胞为主要效应细胞，既具有T淋巴细胞强大杀伤活性，也具有自然杀伤细胞杀伤时的非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性[5]。CIK治疗已在肝癌、肺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中开展，显示出一定的疗效[6-9]，但在实体瘤中的疗效缺乏持久性[10]。
近年来，免疫检查点抑制剂(以PD-1单抗为代表)和过继免疫T细胞(包括CAR-T、自体体外扩增T细胞)治疗成为肿瘤免疫治疗的两大免疫治疗方法[11]。单用PD-1抗体在实体肿瘤中客观反应率很少超过20%[12]。而过继免疫T细胞在实体肿瘤的治疗中的问题主要有：(1)肿瘤微环境中过继免疫T细胞的浸润数量不足；(2)肿瘤微环境中多种具有免疫调节活性的酶表达上调，如吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase，IDO)等，导致T细胞活化不足和T细胞抑制，使T细胞抗肿瘤效应不能持久；(3)输注的肿瘤特异性T细胞会上调PD-1等共抑制受体，而肿瘤细胞可通过T细胞活化介导的辅助性T细胞1(helper T cell 1，Th1)细胞因子的释放产生PD-L1等共抑制配体，从而产生免疫抑制[13-14]。近期研究[15-16]采用联合免疫检查点抑制剂、工程改造免疫细胞等方法，使其拮抗肿瘤微环境中的抑制信号，进而增强过继细胞治疗疗效。其中，PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥重要作用[17-18]。在NK细胞的扩增中加入PD-1抗体能够增强其对骨髓瘤细胞的杀伤能力[19]。一项Ⅰ期临床研究[20]采用体外经派姆单抗(pembrolizumab)处理的DC-CIK治疗既往治疗失败的晚期实体瘤，发现其具有明显的抗肿瘤活性，总体疾病控制率可达64.5%。
本研究的新型T细胞优化策略是自外周血获取T细胞，予以T细胞刺激，并扩大培养，同时采用PD-1单抗与T细胞共孵育，封闭T细胞表面的PD-L1受体，获得杀伤功能提高的T淋巴细胞(PD-1单抗激活的新型T淋巴细胞)。该新型T细胞具有以下优势：对恶性肿瘤细胞的天然识别性，同时可拮抗肿瘤微环境中主要抑制性信号(肿瘤细胞表达的PD-L1)。本研究结果证实了新型T细胞治疗的安全性，且患者生活质量在治疗后有明显提高。
在肿瘤控制方面，单用新型T细胞治疗疗效不佳，可能是因为这部分难治性患者肿瘤微环境处于高度免疫抑制状态，即使回输的T细胞进行了PD-1抗体的诱导培养，也难以逆转其免疫抑制状态。新型T细胞治疗联合标准治疗则疗效较为满意。
本研究进一步分析显示，Treg高表达可能是抗肿瘤免疫治疗疗效不佳的原因之一。Treg是一群特殊的具有免疫抑制功能的T细胞亚群。在肿瘤形成过程中，Treg细胞能保护肿瘤组织免受免疫系统的清除，促进肿瘤生长。Treg能通过胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)通路保护肿瘤细胞免受免疫系统的攻击，进而影响免疫治疗疗效[21]。
综上所述，新型T细胞治疗较为安全，治疗后患者生活质量改善，联合标准治疗显示出较满意的疗效。在完成新型T细胞临床安全性、耐受性及疗效评价的基础上，可进一步通过检测相关预测指标(如Treg)，优选治疗人群，进而探索新型T细胞联合治疗方案在肿瘤治疗各阶段的可行性。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
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