2. 南昌大学第二附属医院胸心外科, 南昌 330006
2. Department of Cardiothoracic Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi, China
肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤,同时也是肿瘤相关死亡的首要原因,每年约造成200万例患者死亡[1]。临床上通常把肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其中NSCLC约占85%[2]。尽管近几年肺癌的诊断和治疗方法取得很大进步,但由于其早期转移和高复发率,患者的5年生存率只有约20%[3-4]。因此,寻找准确可靠的标志物对于肺癌的早期诊断和治疗,以及改善患者预后具有重要意义。
转录因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1,PROX1)是果蝇Prospero的同源物,可调节多种器官的发育[5]。最近的研究[6-10]表明,PROX1在多种肿瘤中发挥作用,但在不同类型的肿瘤中,其对肿瘤生物学行为的影响具有较大差异。PROX1在甲状腺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤中发挥抑制作用,而在结直肠癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤中发挥促癌作用。然而,PROX1在NSCLC发生发展中的作用以及对预后的影响仍不清楚。本研究将进一步探究PROX1对NSCLC生物学行为的影响及相关分子机制。
1 材料与方法 1.1 研究样本收集2014年6月至2015年7月在复旦大学附属中山医院接受标准的108例肺叶切除术和纵隔淋巴结清扫术患者的108对NSCLC肿瘤和相应的癌旁组织,用于制作组织芯片。患者相关临床病理资料均从复旦大学附属中山医院数据库中获得,最后一次随访时间为2020年5月。本研究已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会审查(Y2019-187),所有患者均知情并签署知情同意书。
1.2 细胞培养及转染NSCLC细胞系A549细胞购买于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,培养条件:DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗,于37℃含5%CO2的培养箱培养。病毒转染:PROX1敲减的慢病毒由上海吉满生物公司合成。敲减的序列:shPROX1-1为5′-TTT CCA GGA GCA ACC ATA ATT- 3′; shPROX1-2为5′-GGC TCT CCT TGT CGC TCA TAA- 3′。转染时将细胞重悬计数后以2×105个/孔的密度铺在6孔板内,放入培养箱中培养24 h,然后加入含有1×106 TU/mL病毒的培养基3 mL,再加入5 μg/mL的polybrene,继续培养24 h后倒掉培养基,加入新的培养基,继续培养48 h后检测PROX1蛋白表达情况。
1.3 免疫组化染色组织芯片由上海芯超公司制作完成,组织芯片于60℃烘烤3 h,用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡后,用梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)水化。后用过氧化氢孵育30 min,柠檬酸钠修复高火15 min,山羊血清封闭1 h后加入PROX1一抗(1∶500,Abcam公司,英国),4℃过夜后用辣根过氧化物酶孵育1 h后DAB染色,显微镜观察染色深度至合适时终止显色。苏木精复染40 s,水洗20 min,然后逆乙醇梯度脱水,二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ各浸泡5 min后晾干,中性树脂封片。免疫组化评分标准:染色强度(0,未染色;1,轻度染色;2,中度染色,3,强染色)以及染色密度(1,≤25%;2,26%~50%;3,51%~75%;4,>75%)。最终评分为染色强度+染色密度,得分≥4被定义为PROX1高表达组,得分≤3被定义为PROX1低表达组。
1.4 qRT-PCR采用碧云天RNA提取柱提取RNA后,采用NanoDrop 2000测定RNA浓度并用逆转录试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司,中国)将其反转录为cDNA。温度条件:5 min,25℃;30 min,42℃;5 min;85℃。而后使用PCR仪(Applied Biosystems)进行RT-qPCR。反应条件:95℃,10 s;55~60℃,20 s;72℃,20 s,共40个循环。PROX1引物序列:F为CCC GTT ATG CCA GCT CCA ATA;R为CGT GCG TAC TTC TCC ATC TGA A。GAPDH引物序列:F为TCA GCA ATG CCT CCT GCA C; R为TGG CAT GGA CTG TGG TCA ATG。E-cadherin的引物序列:F为GAA CGC ATT GCC ACA TAC AC;R为GAA TTC GGG CTT GTT GTC AT。Vimentin的引物序列:F为TTG CCG TTG AAG CTG CTA ACT ACC;R为AAT CCT GCT CTC CTC GCC TTC C。
1.5 Western印迹法检测采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白后,BCA法测定蛋白浓度,统一调整为4 μg/μL。蛋白上样后进行电泳(150 V,60 min),而后进行转膜(0.28 mA,1.5 h),将蛋白转移至PVDF膜上,快速封闭液封闭20 min后一抗孵育(1∶1000),4℃摇晃过夜,第2天用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h,ECL发光显影。
1.6 Transwell实验 1.6.1 迁移实验细胞用无血清培养基重悬,向小室上层加入5×104个细胞,总体积为200 μL,下层加入正常培养基500 μL,37℃培养箱培养24 h,后用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫溶液染色,显微镜下拍照计数。
1.6.2 侵袭实验小室上层铺入60 μL(按1∶8稀释)基质胶后,放入37℃培养箱中培养30 min。细胞用无血清培养基重悬后,向小室上层加入1×105个细胞,约200 μL,下层加入正常培养基500 μL,37℃培养箱培养48 h,后用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫溶液染色,显微镜下拍照计数。
1.6.3 CCK-8实验细胞重悬计数后,96孔板内每孔加入1 000个细胞,总体积为100 μL,孵育7 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,继续37℃培养2 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光度,后每24 h测1次,连测4 d。
1.7 统计学处理采用SPSS 23.0进行统计分析。计数资料以n(%)表示,采用χ2检验,符合正态分布的计量资料以x±s表示,采用Student’s t检验。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验用于比较不同组间的预后。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 PROX1在NSCLC中的表达结果(图 1)显示:在108例NSCLC患者中,有55例(50.9%)肿瘤组织中PROX1高表达,并且在肿瘤中的表达高于对应的癌旁组织。
2.2 PROX1高、低表达组的一般资料分析结果(表 1)显示:肿瘤直径和淋巴转移在PROX1高低表达组间差异有统计学意义(P=0.003、0.042),其他指标差异无统计学意义。
n(%) | |||||||||||||||||||||||||||||
指标 | PROX1表达 | χ2值 | P值 | ||||||||||||||||||||||||||
低(n=53) | 高(n=55) | ||||||||||||||||||||||||||||
性别 | 0.308 | 0.579 | |||||||||||||||||||||||||||
男 | 24(22.2) | 22(20.4) | |||||||||||||||||||||||||||
女 | 29(26.9) | 33(30.5) | |||||||||||||||||||||||||||
年龄/岁 | 0.297 | 0.586 | |||||||||||||||||||||||||||
≤60 | 35(32.4) | 39(36.1) | |||||||||||||||||||||||||||
>60 | 18(16.7) | 16(14.8) | |||||||||||||||||||||||||||
吸烟 | 2.338 | 0.126 | |||||||||||||||||||||||||||
是 | 26(24.1) | 19(17.6) | |||||||||||||||||||||||||||
否 | 27(25.0) | 36(33.3) | |||||||||||||||||||||||||||
病理类型 | 0.548 | 0.459 | |||||||||||||||||||||||||||
腺癌 | 40(37.0) | 38(35.2) | |||||||||||||||||||||||||||
鳞癌 | 13(12.0) | 17(15.7) | |||||||||||||||||||||||||||
肿瘤直径/cm | 9.031 | 0.003 | |||||||||||||||||||||||||||
≤3 | 40(37.0) | 26(24.1) | |||||||||||||||||||||||||||
>3 | 13(12.0) | 29(26.9) | |||||||||||||||||||||||||||
病理分化 | 2.331 | 0.312 | |||||||||||||||||||||||||||
Ⅱ | 20(18.5) | 19(17.6) | |||||||||||||||||||||||||||
Ⅱ~Ⅲ | 30(27.8) | 28(25.9) | |||||||||||||||||||||||||||
Ⅲ | 3(2.8) | 8(7.4) | |||||||||||||||||||||||||||
淋巴转移 | 4.125 | 0.042 | |||||||||||||||||||||||||||
是 | 15(13.9) | 26(24.1) | |||||||||||||||||||||||||||
否 | 38(35.2) | 29(26.8) | |||||||||||||||||||||||||||
分期 | 0.002 | 0.963 | |||||||||||||||||||||||||||
Ⅰ~Ⅱ | 50(46.3) | 52(48.1) | |||||||||||||||||||||||||||
Ⅲ~Ⅳ | 3(2.8) | 3(2.8) |
结果(图 2)显示,高表达PROX1的NSCLC患者其5年复发率高于PROX1低表达组(70.9% vs 50.9%,P=0.005),而5年生存率低于PROX1低表达组(49.1% vs 66%,P=0.016)。
2.4 NSCLC患者的预后Cox单因素和多因素分析结果(表 2、表 3)显示,淋巴转移和PROX1的表达是影响NSCLC患者术后肿瘤复发和死亡风险的独立影响因素(P < 0.05)。
因素 | 单因素 | 多因素 | |||
P值 | HR | P值 | 95%CI | ||
性别(男vs女) | 0.337 | ||||
年龄(≤60 vs>60岁) | 0.069 | ||||
吸烟(是vs否) | 0.304 | ||||
病理类型(腺癌vs鳞癌) | 0.595 | ||||
肿瘤直径(>3 vs ≤3 cm) | 0.048 | 0.545 | |||
病理分化(Ⅱ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅲ) | 0.897 | ||||
淋巴转移(是vs否) | < 0.001 | 2.43 | 1.467~4.025 | 0.001 | |
TNM分期(Ⅰ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅳ) | 0.856 | ||||
PROX1表达(高vs低) | 0.005 | 1.764 | 1.059~2.938 | 0.013 |
因素 | 单因素 | 多因素 | |||
P值 | HR | P值 | 95%CI | ||
性别(男vs女) | 0.769 | ||||
年龄(≤60 vs>60岁) | 0.104 | ||||
吸烟(是vs否) | 0.314 | ||||
病理类型(腺癌vs鳞癌) | 0.659 | ||||
肿瘤直径(>3 vs ≤ 3 cm) | 0.795 | ||||
病理分化(Ⅱ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅲ) | 0.948 | ||||
淋巴转移(是vs否) | 0.001 | 2.427 | 1.381~4.264 | 0.002 | |
TNM分期(Ⅰ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅳ) | 0.814 | ||||
PROX1表达(高vs低) | 0.019 | 1.781 | 1.005~3.155 | 0.048 |
在A549细胞系中构建了PROX1敲减模型,并且Western印迹法证实了PROX1在A549细胞系中被成功敲减(图 3A)。CCK-8实验结果(图 3B)表明,敲减PROX1后NSCLC细胞的增殖能力明显减弱(P < 0.01)。Transwell实验结果(图 3C)表明,敲减PROX1后NSCLC细胞的侵袭和迁移能力明显减弱(P < 0.05)。因此,通过以上功能实验发现,PROX1能够促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移。
2.6 PROX1对NSCLC的EMT变化的影响Western印迹法和qRT-PCR结果(图 4A、4B)表明,当敲减A549中的PROX1后,A549中的E-钙黏着蛋白(E-cadhein)表达明显升高而波形蛋白(vimentin)明显降低(P < 0.001)。证实PROX1可诱导NSCLC的EMT变化,从而导致肿瘤进展。
3 讨论目前有关PROX1在肿瘤发生发展中作用的研究很多[6-7, 9-10]。既往研究[11-12]显示,PROX1在肝癌、前列腺癌等多个类型的肿瘤中促进肿瘤的发生和发展,但是其在NSCLC中的临床意义仍不明确,并且PROX1在NSCLC中相应的功能和机制也有待进一步探究。因此,本研究首次明确了PROX1在NSCLC中的功能和相关分子机制。通过对NSCLC患者的组织芯片进行PROX1免疫组化染色发现,在部分NSCLC患者中PROX1高表达,并且高表达PROX1的NSCLC患者其生存预后较低表达组差。进一步通过功能实验证实了PROX1可以促进NSCLC的增殖、侵袭和转移。在机制方面发现,EMT在PROX1参与NSCLC进展中发挥着重要作用。
EMT是指从上皮细胞向间质细胞的表型转变[13]。既往文献[14]报道,EMT在胚胎发育、组织修复与纤维化以及肿瘤发生发展中发挥重要作用,肿瘤细胞通过EMT变化显著增强了其增殖、侵袭和转移能力。当上皮细胞通过EMT获得向周围侵袭转移能力的同时,细胞会部分丧失上皮标志物,如E-钙黏着蛋白,并获间质标志物,如波形蛋白,因此这2个蛋白也是检测肿瘤EMT变化的重要标志物[15]。根据既往文献[16]报道,EMT也是NSCLC发生发展过程中的重要机制,并且研究广泛。在肝细胞肝癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤中已经有很多关于PROX1通过促进EMT促进肿瘤进展的机制研究[11-12, 17],并且报道显示,PROX1也是预测肿瘤复发转移的重要标志物。PROX1过表达的细胞中,波形蛋白表达升高而E-钙黏着蛋白表达下降;当下调PROX1的表达时,E-钙黏着蛋白表达上调而波形蛋白表达下降[10-12, 18]。这与本研究结果一致,本研究中敲减NSCLC中的PROX1时,E-钙黏着蛋白的表达升高而波形蛋白的表达明显下降。因此,PROX1可能通过EMT过程促进NSCLC的增殖、迁移和侵袭。
综上所述,PROX1的表达与NSCLC的恶性程度相关,高表达PROX1的NSCLC患者预后更差,PROX1主要通过EMT促进NSCLC的进展。PROX1可能作为判断NSCLC预后的可靠预测因子,同时也是潜在的治疗靶点。
利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突。
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