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   中国临床医学  2021, Vol. 28 Issue (5): 802-807      DOI: 10.12025/j.issn.1008-6358.2021.20210443
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PROX1通过上皮间质转化促进非小细胞肺癌进展
高健1 , 敖永强1 , 张领先2 , 王帅1 , 丁建勇1 , 蒋家好1     
1. 复旦大学附属中山医院胸外科, 上海 230032;
2. 南昌大学第二附属医院胸心外科, 南昌 330006
摘要目的: 探讨转录因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1,PROX1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)进展中的作用和机制。方法: 对含有108对非小细胞肺癌组织的组织芯片进行免疫组化染色,分析PROX1表达和NSCLC患者预后间的关系。采用Western印迹法和实时定量PCR分析PROX1在NSCLC细胞系中的表达情况和上皮间质转化的标志物。采用CCK-8、Transwell试验检测肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果: PROX1在非小细胞肺癌组织中的表达上调。PROX1的表达与肿瘤直径、淋巴转移显著相关(P=0.003、0.042)。高表达PROX1的NSCLC患者其5年复发率高于PROX1低表达组(70.9%vs 50.9%,P=0.005),而5年生存率低于PROX1低表达组(49.1%vs 66.0%,P=0.016)。CCK-8和Transwell实验的结果显示,敲减PROX1后肿瘤的增殖、侵袭和转移能力明显减弱(P < 0.01、P < 0.05)。敲减PROX1后E-钙粘蛋白表达上调而波形蛋白表达下降(P < 0.001)。结论: PROX1表达增高可通过促进上皮间质转化而促进NSCLC进展;PROX1是潜在的NSCLC预后预测因子。
关键词转录因子Prospero同源框1    非小细胞肺癌    上皮间质转化    预后    
PROX1 promoted the progression of non-small cell lung cancer via epithelial-mesenchymal transition
GAO Jian1 , AO Yong-qiang1 , ZHANG Ling-xian2 , WANG Shuai1 , DING Jian-yong1 , JIANG Jia-hao1     
1. Department of Thoracic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;
2. Department of Cardiothoracic Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi, China
Abstract: Objective: To explore the function and mechanism of PROX1 in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The tissue micro-array containing 108 NSCLC tissues was used to explore the relationship between the expression of PROX1 and the prognosis of NSCLC patients. Western blot and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) were used to detect the expression of PROX1 in the NSCLC cell line and detect the biomarkers of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Moreover, the CCK8 and Transwell assay was used to detect the proliferation, invasion, and migration ability of the NSCLC cell line. Results: The expression of PROX1 was upregulated in NSCLC. The expression of PROX1 was closely associated with tumor size and lymphocyte metastasis (P=0.003 and 0.042). The NSCLC patients in the PROX1 high group had a higher recurrence rate and lower survival rate than in the PROX1 low group with the five-year recurrence rate (70.9% vs 50.9%, P=0.005) and the five-year survival rate (49.1% vs 66%, P=0.016). The CCK-8 and Transwell assays showed that the proliferation, invasion, and migration of NSCLC were significantly reduced after the knockdown of PROX1(P < 0.01、P < 0.05). In terms of mechanism, the knockdown of PROX1 led to the upregulation of E-cadherin and reduction of vimentin(P < 0.001). Conclusions: The upregulation of PROX1 contributes to the progression of NSCLC through EMT and it can be a potential biomarker for the prognosis of NSCLC.
Key words: Prospero-related homeobox 1    non-small cell lung cancer    epithelial-mesenchymal transition    prognosis    

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤,同时也是肿瘤相关死亡的首要原因,每年约造成200万例患者死亡[1]。临床上通常把肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其中NSCLC约占85%[2]。尽管近几年肺癌的诊断和治疗方法取得很大进步,但由于其早期转移和高复发率,患者的5年生存率只有约20%[3-4]。因此,寻找准确可靠的标志物对于肺癌的早期诊断和治疗,以及改善患者预后具有重要意义。

转录因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1,PROX1)是果蝇Prospero的同源物,可调节多种器官的发育[5]。最近的研究[6-10]表明,PROX1在多种肿瘤中发挥作用,但在不同类型的肿瘤中,其对肿瘤生物学行为的影响具有较大差异。PROX1在甲状腺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤中发挥抑制作用,而在结直肠癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤中发挥促癌作用。然而,PROX1在NSCLC发生发展中的作用以及对预后的影响仍不清楚。本研究将进一步探究PROX1对NSCLC生物学行为的影响及相关分子机制。

1 材料与方法 1.1 研究样本

收集2014年6月至2015年7月在复旦大学附属中山医院接受标准的108例肺叶切除术和纵隔淋巴结清扫术患者的108对NSCLC肿瘤和相应的癌旁组织,用于制作组织芯片。患者相关临床病理资料均从复旦大学附属中山医院数据库中获得,最后一次随访时间为2020年5月。本研究已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会审查(Y2019-187),所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 细胞培养及转染

NSCLC细胞系A549细胞购买于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,培养条件:DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗,于37℃含5%CO2的培养箱培养。病毒转染:PROX1敲减的慢病毒由上海吉满生物公司合成。敲减的序列:shPROX1-1为5′-TTT CCA GGA GCA ACC ATA ATT- 3′; shPROX1-2为5′-GGC TCT CCT TGT CGC TCA TAA- 3′。转染时将细胞重悬计数后以2×105个/孔的密度铺在6孔板内,放入培养箱中培养24 h,然后加入含有1×106 TU/mL病毒的培养基3 mL,再加入5 μg/mL的polybrene,继续培养24 h后倒掉培养基,加入新的培养基,继续培养48 h后检测PROX1蛋白表达情况。

1.3 免疫组化染色

组织芯片由上海芯超公司制作完成,组织芯片于60℃烘烤3 h,用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡后,用梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)水化。后用过氧化氢孵育30 min,柠檬酸钠修复高火15 min,山羊血清封闭1 h后加入PROX1一抗(1∶500,Abcam公司,英国),4℃过夜后用辣根过氧化物酶孵育1 h后DAB染色,显微镜观察染色深度至合适时终止显色。苏木精复染40 s,水洗20 min,然后逆乙醇梯度脱水,二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ各浸泡5 min后晾干,中性树脂封片。免疫组化评分标准:染色强度(0,未染色;1,轻度染色;2,中度染色,3,强染色)以及染色密度(1,≤25%;2,26%~50%;3,51%~75%;4,>75%)。最终评分为染色强度+染色密度,得分≥4被定义为PROX1高表达组,得分≤3被定义为PROX1低表达组。

1.4 qRT-PCR

采用碧云天RNA提取柱提取RNA后,采用NanoDrop 2000测定RNA浓度并用逆转录试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司,中国)将其反转录为cDNA。温度条件:5 min,25℃;30 min,42℃;5 min;85℃。而后使用PCR仪(Applied Biosystems)进行RT-qPCR。反应条件:95℃,10 s;55~60℃,20 s;72℃,20 s,共40个循环。PROX1引物序列:F为CCC GTT ATG CCA GCT CCA ATA;R为CGT GCG TAC TTC TCC ATC TGA A。GAPDH引物序列:F为TCA GCA ATG CCT CCT GCA C; R为TGG CAT GGA CTG TGG TCA ATG。E-cadherin的引物序列:F为GAA CGC ATT GCC ACA TAC AC;R为GAA TTC GGG CTT GTT GTC AT。Vimentin的引物序列:F为TTG CCG TTG AAG CTG CTA ACT ACC;R为AAT CCT GCT CTC CTC GCC TTC C。

1.5 Western印迹法检测

采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白后,BCA法测定蛋白浓度,统一调整为4 μg/μL。蛋白上样后进行电泳(150 V,60 min),而后进行转膜(0.28 mA,1.5 h),将蛋白转移至PVDF膜上,快速封闭液封闭20 min后一抗孵育(1∶1000),4℃摇晃过夜,第2天用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h,ECL发光显影。

1.6 Transwell实验 1.6.1 迁移实验

细胞用无血清培养基重悬,向小室上层加入5×104个细胞,总体积为200 μL,下层加入正常培养基500 μL,37℃培养箱培养24 h,后用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫溶液染色,显微镜下拍照计数。

1.6.2 侵袭实验

小室上层铺入60 μL(按1∶8稀释)基质胶后,放入37℃培养箱中培养30 min。细胞用无血清培养基重悬后,向小室上层加入1×105个细胞,约200 μL,下层加入正常培养基500 μL,37℃培养箱培养48 h,后用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫溶液染色,显微镜下拍照计数。

1.6.3 CCK-8实验

细胞重悬计数后,96孔板内每孔加入1 000个细胞,总体积为100 μL,孵育7 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,继续37℃培养2 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光度,后每24 h测1次,连测4 d。

1.7 统计学处理

采用SPSS 23.0进行统计分析。计数资料以n(%)表示,采用χ2检验,符合正态分布的计量资料以x±s表示,采用Student’s t检验。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验用于比较不同组间的预后。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 PROX1在NSCLC中的表达

结果(图 1)显示:在108例NSCLC患者中,有55例(50.9%)肿瘤组织中PROX1高表达,并且在肿瘤中的表达高于对应的癌旁组织。

图 1 PROX1在NSCLC及癌旁中的表达
2.2 PROX1高、低表达组的一般资料分析

结果(表 1)显示:肿瘤直径和淋巴转移在PROX1高低表达组间差异有统计学意义(P=0.003、0.042),其他指标差异无统计学意义。

表 1 PROX1高、低表达组的一般资料分析 
n(%)
指标 PROX1表达 χ2 P
低(n=53) 高(n=55)
性别 0.308 0.579
  男 24(22.2) 22(20.4)
  女 29(26.9) 33(30.5)
年龄/岁 0.297 0.586
  ≤60 35(32.4) 39(36.1)
  >60 18(16.7) 16(14.8)
吸烟 2.338 0.126
  是 26(24.1) 19(17.6)
  否 27(25.0) 36(33.3)
病理类型 0.548 0.459
  腺癌 40(37.0) 38(35.2)
  鳞癌 13(12.0) 17(15.7)
肿瘤直径/cm 9.031 0.003
  ≤3 40(37.0) 26(24.1)
  >3 13(12.0) 29(26.9)
病理分化 2.331 0.312
  Ⅱ 20(18.5) 19(17.6)
  Ⅱ~Ⅲ 30(27.8) 28(25.9)
  Ⅲ 3(2.8) 8(7.4)
淋巴转移 4.125 0.042
  是 15(13.9) 26(24.1)
  否 38(35.2) 29(26.8)
分期 0.002 0.963
  Ⅰ~Ⅱ 50(46.3) 52(48.1)
  Ⅲ~Ⅳ 3(2.8) 3(2.8)
2.3 PROX1高、低表达组的预后分析

结果(图 2)显示,高表达PROX1的NSCLC患者其5年复发率高于PROX1低表达组(70.9% vs 50.9%,P=0.005),而5年生存率低于PROX1低表达组(49.1% vs 66%,P=0.016)。

图 2 PROX1高表达组和低表达组的复发和生存比较的生存曲线 A:PROX1高表达和低表达组术后复发的比较;B:PROX1高表达组和低表达组术后生存的比较。
2.4 NSCLC患者的预后Cox单因素和多因素分析

结果(表 2表 3)显示,淋巴转移和PROX1的表达是影响NSCLC患者术后肿瘤复发和死亡风险的独立影响因素(P < 0.05)。

表 2 NSCLC术后复发相关Cox单因素和多因素分析
因素 单因素 多因素
P HR P 95%CI
性别(男vs女) 0.337
年龄(≤60 vs>60岁) 0.069
吸烟(是vs否) 0.304
病理类型(腺癌vs鳞癌) 0.595
肿瘤直径(>3 vs ≤3 cm) 0.048 0.545
病理分化(Ⅱ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅲ) 0.897
淋巴转移(是vs否) < 0.001 2.43 1.467~4.025 0.001
TNM分期(Ⅰ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅳ) 0.856
PROX1表达(高vs低) 0.005 1.764 1.059~2.938 0.013
表 3 NSCLC患者术后生存相关Cox单因素和多因素分析
因素 单因素 多因素
P HR P 95%CI
性别(男vs女) 0.769
年龄(≤60 vs>60岁) 0.104
吸烟(是vs否) 0.314
病理类型(腺癌vs鳞癌) 0.659
肿瘤直径(>3 vs ≤ 3 cm) 0.795
病理分化(Ⅱ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅲ) 0.948
淋巴转移(是vs否) 0.001 2.427 1.381~4.264 0.002
TNM分期(Ⅰ~Ⅱ vs Ⅲ~Ⅳ) 0.814
PROX1表达(高vs低) 0.019 1.781 1.005~3.155 0.048
2.5 PROX1对NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移作用

在A549细胞系中构建了PROX1敲减模型,并且Western印迹法证实了PROX1在A549细胞系中被成功敲减(图 3A)。CCK-8实验结果(图 3B)表明,敲减PROX1后NSCLC细胞的增殖能力明显减弱(P < 0.01)。Transwell实验结果(图 3C)表明,敲减PROX1后NSCLC细胞的侵袭和迁移能力明显减弱(P < 0.05)。因此,通过以上功能实验发现,PROX1能够促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移。

图 3 体外验证敲减PROX1对肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响 A:Western印迹法检测PROX1在A549细胞系中的表达以及敲减效果;B:CCK-8实验检测PROX1敲减前后NSCLC的增殖能力变化;C:Transwell实验检测PROX1敲减前后NSCLC的侵袭和迁移能力变化。*P < 0.05; **P < 0.01。
2.6 PROX1对NSCLC的EMT变化的影响

Western印迹法和qRT-PCR结果(图 4A4B)表明,当敲减A549中的PROX1后,A549中的E-钙黏着蛋白(E-cadhein)表达明显升高而波形蛋白(vimentin)明显降低(P < 0.001)。证实PROX1可诱导NSCLC的EMT变化,从而导致肿瘤进展。

图 4 敲减PROX1后NSCLC中EMT标志物表达的变化 A:Western印迹法检测PROX1敲减后E-cadherin和vimentin蛋白表达变化;B:qRT-PCR检测PROX1敲减后E-cadherin和vimentin的mRNA表达变化。***P < 0.001。
3 讨论

目前有关PROX1在肿瘤发生发展中作用的研究很多[6-7, 9-10]。既往研究[11-12]显示,PROX1在肝癌、前列腺癌等多个类型的肿瘤中促进肿瘤的发生和发展,但是其在NSCLC中的临床意义仍不明确,并且PROX1在NSCLC中相应的功能和机制也有待进一步探究。因此,本研究首次明确了PROX1在NSCLC中的功能和相关分子机制。通过对NSCLC患者的组织芯片进行PROX1免疫组化染色发现,在部分NSCLC患者中PROX1高表达,并且高表达PROX1的NSCLC患者其生存预后较低表达组差。进一步通过功能实验证实了PROX1可以促进NSCLC的增殖、侵袭和转移。在机制方面发现,EMT在PROX1参与NSCLC进展中发挥着重要作用。

EMT是指从上皮细胞向间质细胞的表型转变[13]。既往文献[14]报道,EMT在胚胎发育、组织修复与纤维化以及肿瘤发生发展中发挥重要作用,肿瘤细胞通过EMT变化显著增强了其增殖、侵袭和转移能力。当上皮细胞通过EMT获得向周围侵袭转移能力的同时,细胞会部分丧失上皮标志物,如E-钙黏着蛋白,并获间质标志物,如波形蛋白,因此这2个蛋白也是检测肿瘤EMT变化的重要标志物[15]。根据既往文献[16]报道,EMT也是NSCLC发生发展过程中的重要机制,并且研究广泛。在肝细胞肝癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤中已经有很多关于PROX1通过促进EMT促进肿瘤进展的机制研究[11-12, 17],并且报道显示,PROX1也是预测肿瘤复发转移的重要标志物。PROX1过表达的细胞中,波形蛋白表达升高而E-钙黏着蛋白表达下降;当下调PROX1的表达时,E-钙黏着蛋白表达上调而波形蛋白表达下降[10-12, 18]。这与本研究结果一致,本研究中敲减NSCLC中的PROX1时,E-钙黏着蛋白的表达升高而波形蛋白的表达明显下降。因此,PROX1可能通过EMT过程促进NSCLC的增殖、迁移和侵袭。

综上所述,PROX1的表达与NSCLC的恶性程度相关,高表达PROX1的NSCLC患者预后更差,PROX1主要通过EMT促进NSCLC的进展。PROX1可能作为判断NSCLC预后的可靠预测因子,同时也是潜在的治疗靶点。

利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突。

参考文献
[1]
BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424. [DOI]
[2]
HERBST R S, MORGENSZTERN D, BOSHOFF C. The biology and management of non-small cell lung cancer[J]. Nature, 2018, 553(7689): 446-454. [DOI]
[3]
DUMA N, SANTANA-DAVILA R, MOLINA J R. Non-small cell lung cancer: epidemiology, screening, diagnosis, and treatment[J]. Mayo Clin Proc, 2019, 94(8): 1623-1640. [DOI]
[4]
CHAUHAN A F, LIU S V. Small cell lung cancer: advances in diagnosis and management[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2020, 41(3): 435-446. [DOI]
[5]
ELSIR T, SMITS A, LINDSTRÖM M S, et al. Transcription factor PROX1:its role in development and cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2012, 31(3-4): 793-805. [DOI]
[6]
CHOI D, RAMU S, PARK E, et al. Aberrant activation of notch signaling inhibits PROX1 activity to enhance the malignant behavior of thyroid cancer cells[J]. Cancer Res, 2016, 76(3): 582-593. [DOI]
[7]
VERSMOLD B, FELSBERG J, MIKESKA T, et al. Epigenetic silencing of the candidate tumor suppressor gene PROX1 in sporadic breast cancer[J]. Int J Cancer, 2007, 121(3): 547-554. [DOI]
[8]
LAITINEN A, BÖCKELMAN C, HAGSTRÖM J, et al. High PROX1 expression in gastric cancer predicts better survival[J]. PLoS One, 2017, 12(8): e183868.
[9]
ELSIR T, ERIKSSON A, ORREGO A, et al. Expression of PROX1 is a common feature of high-grade malignant astrocytic gliomas[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2010, 69(2): 129-138. [DOI]
[10]
SKOG M, BONO P, LUNDIN M, et al. Expression and prognostic value of transcription factor PROX1 in colorectal cancer[J]. Br J Cancer, 2011, 105(9): 1346-1351. [DOI]
[11]
LIU Y, ZHANG J B, QIN Y, et al. PROX1 promotes hepatocellular carcinoma metastasis by way of up-regulating hypoxia-inducible factor 1α expression and protein stability[J]. Hepatology, 2013, 58(2): 692-705. [DOI]
[12]
WANG B, HUANG J, ZHOU J, et al. DAB2IP regulates EMT and metastasis of prostate cancer through targeting PROX1 transcription and destabilizing HIF1α protein[J]. Cell Signal, 2016, 28(11): 1623-1630. [DOI]
[13]
TRIPATHI S, LEVINE H, JOLLY M K. The physics of cellular decision making during epithelial-mesenchymal transition[J]. Annu Rev Biophys, 2020, 49: 1-18. [DOI]
[14]
DOMINGUEZ C, DAVID J M, PALENA C. Epithelial-mesenchymal transition and inflammation at the site of the primary tumor[J]. Semin Cancer Biol, 2017, 47: 177-184. [DOI]
[15]
DAS V, BHATTACHARYA S, CHIKKAPUTTAIAH C, et al. The basics of epithelial-mesenchymal transition (EMT): a study from a structure, dynamics, and functional perspective[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(9): 14535-14555. [DOI]
[16]
XIE K, YE Y, ZENG Y, et al. Polymorphisms in genes related to epithelial-mesenchymal transition and risk of non-small cell lung cancer[J]. Carcinogenesis, 2017, 38(10): 1029-1035. [DOI]
[17]
LU M H, HUANG C C, PAN M R, et al. Prospero homeobox 1 promotes epithelial-mesenchymal transition in colon cancer cells by inhibiting E-cadherin via miR-9[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(23): 6416-6425. [DOI]
[18]
SHEN Y, XIA E, BHANDARI A, et al. LncRNA PROX1-AS1 promotes proliferation, invasion, and migration in papillary thyroid carcinoma[J]. Biosci Rep, 2018, 38(5): BSR20180862. [DOI]

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高健, 敖永强, 张领先, 王帅, 丁建勇, 蒋家好. PROX1通过上皮间质转化促进非小细胞肺癌进展[J]. 中国临床医学, 2021, 28(5): 802-807.
GAO Jian, AO Yong-qiang, ZHANG Ling-xian, WANG Shuai, DING Jian-yong, JIANG Jia-hao. PROX1 promoted the progression of non-small cell lung cancer via epithelial-mesenchymal transition[J]. Chinese Journal of Clinical Medicine, 2021, 28(5): 802-807.
通信作者(Corresponding authors).
丁建勇, Tel: 021-64041990, E-mail: ding.jianyong@zs-hospital.sh.cn;
蒋家好, E-mail: jiang.jiahao@zs-hospital.sh.cn.
基金项目
国家自然科学基金(81972168)
Foundation item
Supported by National Natural Science Foundation of China(81972168)

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