目前,结核病仍然是严重威胁人类健康的传染病。2016年WHO发布的统计数据显示,仅2015年,全球范围内就有1 000多万的新发结核病患者,180万人死于结核[1]。结核病的病原菌为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)[2]。最常见的感染部位是肺,而发生在肺外的结核感染更为隐匿,易漏诊[3]。
患者因须明确病变性质到病理科行细胞学检查,其中相当一部分为可疑肺外结核病。本科采用针吸细胞学(fine needle aspiration cytology,FNAC)联合实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)做出诊断与鉴别,效果满意,现报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择湖北省十堰市太和医院2016年4月至2018年12月经FNAC涂片显示为可疑结核病感染或需排除结核病感染的患者57例。其中,男性28例、女性29例,年龄15~77岁,中位年龄39岁。样本来源于表浅可触及体表囊肿的穿刺液,其中淋巴结46例,关节腔2例,泌尿生殖系统4例,胸腹壁5例。
1.2 FNAC检查常规局部消毒,用左手拇指及示指固定穿刺部位,右手持10 mL一次性塑料注射器(7号针头)前后左右多方向穿刺取材。将部分穿刺液均匀涂抹于载玻片上,95%乙醇固定,苏木精-伊红(H-E)染色,在BX51生物显微镜(奥林巴斯)下观察。其余穿刺液预留,用于qPCR检测。
1.3 提取DNA在穿刺液中加入2~3倍体积的4%NaOH溶液,37℃水浴0.5~1 h,至完全液化。16 000×g离心10 min,弃上清,加入1 mL 0.9%氯化钠液并一起移入1.5 mL离心管中。16 000 ×g离心10 min,弃上清,根据沉淀量加入30~50 μL DNA提取液,吹打混匀,37℃水浴30 min,再100℃干浴10 min,16 000 ×g离心10 min,取上清检测DNA。
1.4 qPCR检测荧光定量PCR仪购自ABI公司(ABI7500);结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自qiagen公司。qPCR反应总体系为40 μL,包括反应液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG 0.06 μL及待测DNA样本2 μL。设阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照。PCR反应条件:37℃去除污染5 min;94℃预变性1 min;95℃变性5 s、60℃退火加延伸30 s,共40个循环。实验结果按照说明书进行判读。
2 结果 2.1 临床诊断结果57例可能感染或需排除感染结核分枝杆菌的患者中,判断倾向结核者43例,倾向其他但需排除结核者14例。57例中有临床确诊结果者23例,其中结核分枝杆菌阳性16例、阴性7例(表 1)。
序号 | 部位 | FNAC | qPCR | 临床诊断 |
1 | 左腮腺 | - | - | - |
2 | 左膝关节 | - | - | - |
3 | 左颌下淋巴结 | - | - | - |
4 | 胸大肌脓肿 | - | - | - |
5 | 颈部淋巴结 | - | - | - |
6 | 左腋窝淋巴结 | - | - | - |
7 | 颈部淋巴结 | + | + | - |
8 | 右锁骨上淋巴结 | + | - | + |
9 | 右侧附睾 | + | + | + |
10 | 颈部淋巴结 | + | + | + |
11 | 颈部淋巴结 | + | + | + |
12 | 颈部淋巴结 | + | + | + |
13 | 右上腹壁脓肿 | + | + | + |
14 | 右侧髂腰脓肿 | + | + | + |
15 | 右侧附睾 | + | + | + |
16 | 右锁骨上淋巴结 | + | + | + |
17 | 颈部淋巴结 | + | + | + |
18 | 附睾 | + | + | + |
19 | 颈部淋巴结 | + | + | + |
20 | 胸壁皮下囊肿 | + | - | + |
21 | 颈部淋巴结 | - | + | + |
22 | 颈部淋巴结 | - | + | + |
23 | 颈部淋巴结 | - | + | + |
24 | 颈部淋巴结 | - | - | ND |
25 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
26 | 左侧附睾 | + | + | ND |
27 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
28 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
29 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
30 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
31 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
32 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
33 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
34 | 右侧腋窝淋巴结 | + | + | ND |
35 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
36 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
37 | 颈部淋巴结 | + | - | ND |
38 | 颈部淋巴结 | - | + | ND |
39 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
40 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
41 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
42 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
43 | 颈部淋巴结 | + | - | ND |
44 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
45 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
46 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
47 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
48 | 颈部淋巴结 | + | + | ND |
49 | 右侧背部包块 | + | + | ND |
50 | 右侧腋窝淋巴结 | + | - | ND |
51 | 右侧颌下淋巴结 | - | - | ND |
52 | 左侧腹股沟淋巴结 | + | + | ND |
53 | 右侧颌下淋巴结 | + | + | ND |
54 | 右侧锁骨上淋巴结 | + | + | ND |
55 | 左侧锁骨上淋巴结 | + | + | ND |
56 | 颈部淋巴结 | - | - | ND |
57 | 颈部淋巴结 | - | - | ND |
57例样本中,FNAC检测为结核阳性43例、阴性14例,诊断符合率为82.61%(19/23);假阴性3例、假阳性1例(表 1、图 1)。
2.3 qPCR检测结果57例样本中,qPCR检测为结核分枝杆菌阳性42例、阴性15例,诊断符合率为86.96%(20/23);假阴性2例、假阳性1例(表 1、图 2)。
2.4 FNAC与qPCR联合诊断结果有临床确诊结果的23例患者中,FNAC联合qPCR检测为结核阳性16例、阴性7例,诊断符合率为92.98%(22/23);假阳性1例(表 1)。
3 讨论肺外结核病指发生在肺以外的结核病,发生率占结核病的12.0%~28.5%[4]。肺外结核病的临床表现多不典型,诊断有一定困难。传统的检测方法,如痰涂片找抗酸杆菌、抗酸染色等阳性率低,且结核杆菌培养法周期很长,难以满足临床需要[5]。
与其他检测方法相比,FNAC具有检测快速、创伤小、费用低、特异性高和敏感性高的优点。Saatian等的研究[6]中,100例颈部包块的FNAC检测结果与组织病理检测的符合率可达79%。本研究中,FNAC的阳性预测值为92.86%(13/14),阴性预测值为66.67%(6/9),诊断符合率为82.61%(19/23),与上述研究相似。结核病的细胞学表现多为均匀粉染的彻底性坏死,可见类上皮细胞或郎汉斯巨细胞[7]。但结核病有时与其他类上皮细胞肉芽肿难以鉴别,如真菌感染、结节病等;也可能与某些化脓性感染难以区分,如有液化坏死或混合感染时,也可见脓细胞和坏死物[8]。因此,诊断结核病时,需将FNAC与其他检测方法联合应用。
qPCR可特异性地扩增模板DNA上的一段序列,并通过荧光标记的探针实时记录扩增产物的量,具有操作简便、敏感、特异的优点。目前,qPCR法已广泛应用于石蜡包埋组织样本中结核杆菌核酸的检测[9-10],效果较好,但在穿刺液中的应用还鲜有报道。本研究采用的qPCR试剂盒包含dUTP-UNG酶防污染系统,可有效降低假阳性。在有临床确诊结果的23例患者中,qPCR的阳性预测值为93.33%(14/15),阴性预测值为75%(6/8),与临床诊断的符合率达86.96%(20/23),本研究中qPCR对结核分枝杆菌感染的检测率较高除了与其准确率较高有关外,还与前期FNAC筛选及例数较少有一定关系。为避免漏诊,建议对所有FNAC涂片镜检时发现有类上皮细胞,伴或不伴坏死的样本行qPCR检测。
综上所述,FNAC是诊断肺外结核病,尤其是有体表囊肿的肺外结核病的首选手段,可在减轻患者痛苦的基础上减少漏诊。将FNAC和qPCR法联合用于肺外结核病,可提高诊断准确率。
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