结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球发病率第4、死亡率第2的癌症[1]。年龄、性别、遗传等危险因素会导致CRC的发病。多种微生物与癌症的发病相关,如幽门螺杆菌与胃癌、人乳头状病毒与宫颈癌等。因此,肠道菌群在CRC中的作用引起了广泛关注。大约有1 000种不同的微生物栖息在人类胃肠道内[2]。这些微生物对肠道环境稳态的维持具有重要作用。但这个作用是相对的,当肠道微生物菌群发生迁移时,可能导致包括CRC、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)和肥胖在内的各种疾病[3-4]。值得注意的是,肠道菌群分布不均匀,大肠内的细菌密度(每毫升约1 012个细菌)远高于小肠(每毫升约102个细菌)。大肠中的癌症风险也比小肠高12倍[2]。
CRC患者肠道菌群的构成与正常人群存在差异[5],主要表现为益生菌减少和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum,Fn)、大肠杆菌、肠球菌等机会致病菌增多,提示这些微生物可能参与CRC的发病过程[5-6]。为了明确微生物与CRC之间的关系,Castellarin等[7]对CRC组织进行了RNA测序,并与邻近的正常组织进行比较。结果显示,肿瘤组织中Fn的数量显著增加。最近的重复研究[8]也证明了这一点。Fn是专性厌氧的格兰阴性杆菌,广泛分布于口腔、肠道、上呼吸道和阴部[9],也是临床样本中分离出的最常见的微生物之一,常与牙周病、阑尾炎、IBD、呼吸道感染、类风湿关节炎、心血管疾病、绒毛膜羊膜炎、早产、死产、阿尔茨海默病和勒米尔综合征等有关[9-10]。此外,Fn在结肠腺瘤中过度增殖,其在CRC发展的初级阶段起重要作用,且可能影响患者的生存[11]。虽然多项研究表明Fn与CRC之间存在联系,但是其中的机制仍然不明确,本文就相关研究结果作一综述。
1 髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)细胞介导的免疫机制 1.1 MDSC相关免疫机制Kostic等[12]发现,与周围非腺瘤组织相比,人类结直肠腺瘤组织中Fn的含量明显增高;与健康对照组相比,结直肠腺瘤患者的粪便中Fn的含量也增加。Chiu等[13]在CRC小鼠模型中发现,Fn能增加肿瘤负荷、促进炎症标志物表达,促进CD11b+MDSCs浸润。而MDSCs作为免疫抑制细胞在癌症中起抑制免疫反应、促进癌症进展的作用。研究[14]表明,MDSCs可以抑制T细胞向肿瘤浸润,增加基质金属蛋白酶9及血管生成,且能保持干细胞特性。
MDSC是肿瘤相关巨噬细胞(M2型巨噬细胞)、粒细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)的前体[12],在促进肿瘤发展和血管生成中起关键作用(图 1)。巨噬细胞能对肿瘤环境中的不同信号作出反应,可分化为2种不同的功能表型(M1与M2),其中M1表型有阻碍肿瘤进展的功能,而M2表型则可促进肿瘤增殖、迁移和血管生成[15-16]。喂食了Fn的小鼠结直肠肿瘤微环境中M2型巨噬细胞数量增加了7.8倍,导致CD4+T细胞被抑制[12]。Chen等[17]的实验表明,在人类CRC中,M2型是巨噬细胞的主要表型,而Fn感染促进肿瘤微环境内M2型巨噬细胞极化和肿瘤生长。Toll样受体4(TLR4)抑制剂TAK-242预处理能显著降低Fn引起的肿瘤微环境中M2巨噬细胞的极化;在此基础上进行免疫荧光检测,发现TLR4依赖的IL-6/p-STAT3/c-MYC信号通路参与Fn对M2巨噬细胞的极化作用。另一项研究[18]表明,肿瘤组织中Fn DNA的富集与高频度微卫星不稳定(high frequencymicrosatellite instability,MSI-H) CRC中巨噬细胞浸润和CDKN2A甲基化显著相关。Través等的研究[19]则表明,可变读框基因(alternative reading frame, ARF)是CDKN2A的INK4a/ARF位点编码的肿瘤抑制因子,缺乏ARF会使M1型通路受损,导致M2型极化,进而产生致癌作用。由此推测在Fn感染的CRC中,启动子甲基化对CDKN2A的抑制可能与M2巨噬细胞的增加有关。肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophil,TAN)也参与肿瘤的发展、转移和血管生成[20]。另一种Fn喂食的小鼠肠内增加的骨髓免疫细胞是CD103+DCs,这些细胞通过增加Foxp3+调节性T细胞而降低肿瘤免疫[21]。
1.2 NK相关免疫机制Fn能减少体内具有细胞毒作用的NK细胞,从而引起肿瘤细胞免疫逃逸[22]。NK细胞属于固有免疫系统,有激活和抑制2种受体[23]。激活受体可以被肿瘤蛋白、病毒成分、自体分子和应激诱导分子激活[23]。免疫受体尾酪氨酸抑制基序(TIGIT)是一种抑制NK细胞和其他免疫细胞的受体,可被脊髓灰质炎病毒受体(poliovirus receptor, PVR)和nectin-2分子激活。这些配体与TIGIT结合后,通过细胞质结构域、免疫受体酪氨酸基抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,ITIM)启动抑制信号[24]。在NK细胞上,Fn表面的Fap2蛋白与人TIGIT (hTIGIT)受体相互作用,导致抑制性级联反应。CD4+和CD8+细胞也表达TIGIT受体。Gur等[22]研究表明,Fn通过Fap2与TIGIT相互作用抑制T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞的活性。此外,已有研究[25]表明,Fn能够诱导Jurkat T细胞和外周血单核细胞凋亡。Fn通过抑制相关蛋白表达使人T细胞阻滞在G1期[26]。相关免疫机制见图 1。
2 FadA、Fap2和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的毒力机制细菌的毒力因子分为侵袭因子和毒素因子(内外毒素),这些物质帮助细菌侵袭宿主细胞,并对宿主细胞造成毒性作用,这个过程可能影响细胞的信号通路,使其出现癌变倾向。Fn的毒力因子在肠道中也具有这样的作用(图 2)。
2.1 蛋白FadAFadA是存在于Fn上的一种毒性蛋白,具有帮助细菌黏附和破坏上皮细胞、内皮细胞的作用,对于细菌传播至关重要[27]。Rubinstein等[28]利用免疫沉淀和缺失分析来检验野生型Fn 12230上的FadA是否与非癌变人类胚胎肾细胞(HEK-293)和CRC细胞系SW480、DLD1、HCT116、HT29中的E-cadherin细胞外区域结合(除外不表达E-cadherin的RKO细胞系)。结果表明,FadA特异性地与E-cadherin结合,诱导β-catenin/Wnt信号的激活;用E-cadherin的单克隆抗体HECD-1或siRNA下调E-cadherin的表达明显阻碍了HEK-293中野生型Fn 12230的附着和侵袭;同时,野生型Fn 12230可以附着和侵袭全长E-cadherin (CDH1) cDNA转染的RKO细胞。该研究表明,E-cadherin是FadA的特异性结合受体,两者结合引发的β-catenin/Wnt信号激活可导致癌基因、Wnt基因和炎症基因表达水平升高。在上述过程中,网格蛋白参与激活Wnt信号通路,促进CRC的癌变过程。
2.2 蛋白Fap2Fap2是一种半乳糖敏感的血凝素和黏附蛋白,在Fn感染中发挥重要作用[29]。除通过与TIGIT相互作用抑制NK细胞外,Abed等[30]在研究CRC患者肠道中Fn的定植机制时发现,Fn的Fap2蛋白可通过与CRC中高表达的Gal-GalNAc结合介导细菌富集,而用O-聚糖酶降低Gal-GalNAc的表达可减少CRC中Fn的积累。此外,在多种其他类型的腺癌中也发现了高水平的Gal-GalNAc,表明其可能是富含Fn癌症治疗中一个潜在的靶点[30]。
2.3 LPSLPS可与TLR4结合,而TLR4在CRC中过度表达,有促进肿瘤的作用[31]。Wu等[32]发现,用Fn加抗生素喂食组小鼠的肿瘤数量及大小均超过仅用抗生素的控制组。此外,通过用TLR4抑制剂TAK-242阻滞TLR4/p-PAK1/β-catenin信号通路,可以减少Fn诱导的肠肿瘤发生[32],说明Fn通过TLR4/ p-PAK1级联激活β-catenin信号通路可促进肠道肿瘤的起始和发展。β-catenin在CRC发展中具有重要促进作用[33]。已有研究表明,Ser675磷酸化的β-catenin更加稳定和活跃,而在CRC细胞中PAK1可以使其Ser675磷酸化,进而增加β-catenin水平[34]。上述证据提示,LPS介导的TLR4/p-PAK1/β-catenin信号通路是预防和治疗Fn相关CRC的潜在靶点。
3 Fn调节多种致瘤microRNA的表达有多种microRNA在CRC的发生中发挥作用,其中一些还被用于诊断CRC的发生和进展[35-37]。其中,miR-21可以促进肠慢性炎症和结肠炎相关CRC的进展[37]。Yang等[38]发现,Fn可以通过激活TLR4/MYD88/NF-κB通路调节CRC细胞中miR-21的表达。该研究用Fn处理APCMin/+小鼠后,CRC肿瘤数量、肿瘤负荷和肿瘤大小均增加;用Fn处理CRC细胞株后,通过微阵列分析发现,miR-21在所有miRNA中的表达率最高。OHTA等[39]进一步发现,类GTPase转运蛋白(RAS GTPase)活化蛋白家族中的RASA1是miR-21的直接靶点,miR-21被抑制后,RASA1表达增加;而RASA1可以与RAS癌蛋白结合并使其失活。同时,Yu等[40]发现,Fn在CRC细胞系中诱导LC3-Ⅱ表达,进而能扩增自噬通量和促进自噬体合成,并刺激自噬相关蛋白pULK1、ULK1、ATG7在CRC中的表达;而自噬抑制增强了经Fn处理的CRC细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂的敏感性。因此,Fn能通过调节TLR4/MYD88、miR-18a*、miR-4802与ULK1/ATG7自噬网络之间的关系,导致CRC化疗抵抗,从而介导CRC的复发。
4 Fn在微卫星不稳定性(MSI)状态下的致瘤作用MSI指与正常组织相比,肿瘤中的某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成长度改变,出现新的微卫星等位基因现象。MSI特点是在肿瘤微环境中,由于移码突变和免疫原多肽高表达,产生了强烈的抗肿瘤免疫反应。人CRC病理和分子研究[41-42]显示,Fn DNA在MSI-H CRC分子亚型中富集,提示两者存在联系。但是,Park等[18]发现,CD3+肿瘤浸润淋巴细胞密度、程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)表达水平与MSI-H CRC组织中Fn DNA水平无显著相关性;Mima等[42]发现,Fn的数量与CD3+T细胞的密度负相关。最近,Hamada等[43]的研究提示,MSI状态对Fn感染介导的CRC免疫反应有重要影响。该结果也许可以解释这种对立情况。该研究[43]表明,在MSI-H的CRC中,Fn对小鼠自适应性抗肿瘤免疫反应具有显性抑制作用,而在非MSI-H的CRC中则表现为明显的促炎作用。虽然其中的具体机制还不清楚,但上述研究表明MSI表型可能是Fn感染引起CRC的独立影响因素。
5 Fn肠道代谢相关致瘤机制Fn在肿瘤微环境中将多肽和氨基酸作为营养物质的来源。短链脂肪酸和甲酰基亮氨酸苯丙氨酸作为Fn的氨基酸代谢产物,是髓源性细胞的激活剂[12]。此外,Fn特有的电子传递链使其能够在肿瘤微环境缺氧条件下复制生存[44]。
6 小结Fn感染作为CRC的危险因素,相关研究提出了多种可能的机制。其中,TLR4参与多种途径,其介导的IL-6/p-STAT3/c-MYC信号通路参与Fn感染免疫反应[15]; TLR4/p-PAK1级联激活的β-catenin信号通路参与Fn感染毒力机制[32];TLR4/MYD88/NF-κB信号通路以及TLR4/MYD88自噬通路[40]均参与MicroRNA相关作用机制。因此,TLR4可能是Fn影响CRC的重要作用点。另外,MSI状态的不同对Fn感染CRC免疫反应产生不同的影响[43],但具体的机制还不清楚。总之,Fn感染与CRC的关系及相关机制需要更多的研究来揭示。
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